Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

Summary

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

Abstract

Proteine ​​di superficie delle cellule, tra cui proteine ​​della matrice extracellulare, partecipano a tutti i principali processi e le funzioni cellulari, come la crescita, la differenziazione e la proliferazione. Una caratterizzazione completa di queste proteine ​​fornisce informazioni ricche per la scoperta di biomarcatori, identificazione del tipo cellulare, e la selezione della droga-obiettivo, oltre a contribuire ad avanzare la nostra comprensione della biologia e fisiologia cellulare. Proteine ​​di superficie, tuttavia, presentano notevoli difficoltà analitiche, a causa della loro intrinsecamente bassa abbondanza, elevata idrofobicità e pesanti modificazioni post-traduzionali. Approfittando della glicosilazione prevalente sulle proteine ​​di superficie, vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture high-throughput che integra i vantaggi di diversi esistenti mediante N-glycoproteomics. Il nostro metodo può arricchire i glicopeptidi derivati ​​da proteine ​​di superficie e rimuovere i loro glicani per proteomica facili con LC-MS. La N-glycoproteome risolto comprende le informazione di identità proteine ​​e quantità nonché i loro siti di glicosilazione. Questo metodo è stato applicato a una serie di studi in settori quali cancro, cellule staminali, e tossicità da farmaci. La limitazione del metodo risiede nella scarsa abbondanza di proteine ​​di membrana di superficie, tale da richiedere una relativamente grande quantità di campioni per questa analisi rispetto agli studi centrati sulle proteine ​​citosoliche.

Introduction

Proteine ​​di superficie cellulare interagiscono con l'ambiente extracellulare e trasmettere i segnali dall'esterno verso l'interno di una cella. Così, queste proteine, incluse le proteine ​​della matrice extracellulare, giocano ruoli critici in tutti gli aspetti della biologia e fisiologia vanno dalla proliferazione, crescita, migrazione, differenziazione all'invecchiamento e così via cellulare. Proteine ​​di superficie funzionano interagendo con altre cellule, proteine ​​e piccole molecole ^1-3. Caratterizzazione molecolare di proteine ​​della superficie cellulare è di grande interesse non solo per i biologi ma anche per le aziende farmaceutiche, come più del 60% dei farmaci sono mirati alle proteine ​​della superficie cellulare ^4.

Spettrometria di massa tandem (MS), con la sua straordinaria sensibilità, precisione e velocità per l'identificazione di proteine ​​e peptidi, è stato un potente strumento per studi di proteomica globali ^5,6. Eppure, proteine ​​di superficie pongono sfide significative proteomica basati su MS, comeesistono maggior parte delle proteine ​​di superficie in piccole quantità e con modifiche pesanti. Le regioni membrane-spanning delle proteine ​​di superficie li rende idrofobo; questo è particolarmente il caso per le proteine ​​transmembrana multipass. Perciò è difficile da sciogliere proteine ​​di membrana in soluzione acquosa senza l'aiuto di un detersivo; tuttavia l'uso di detergenti generalmente sopprime le prestazioni di HPLC e MS ^1,7,8 nella identificazione delle proteine. Pertanto, proteine ​​di membrana sono stati mal caratterizzato proteomica diretti basati LC-MS.

La glicosilazione è una delle più importanti e abbondanti modificazioni post-traduzionali che avvengono nelle proteine ​​della superficie cellulare ^9. L'enorme complessità e l'eterogeneità dei glicani ostacolano segnale peptidi 'MS ^10. Tuttavia, diversi metodi di proteomica hanno utilizzato questa modifica unica per arricchire proteine ​​di superficie e per rimuovere le frazioni di zucchero da proteine ​​prima analisi LC-MS. Questi metodos comprendono basato lectina affinità cattura ¹¹ e acido borico-based o basati hydrazide-capture chimica ¹² così come separazioni cromatografiche idrofili ^8,13. La rimozione di glicani trasforma proteine ​​di membrana alle proteine ​​regolari e semplifica drasticamente la caratterizzazione MS. Poiché glicosilazione avviene anche in proteine ​​secrete che hanno elevata solubilità in contrasto con proteine ​​di membrana, molti metodi glicoproteomica sono ottimizzati per le proteine ​​solubili, e tendono ad avere minore selettività glicopeptidi e sensibilità quando viene distribuito proteine ​​di membrana ^8,14. Esistono anche altri metodi per arricchire, in particolare, le proteine ​​di superficie cellulare, come quelli che usano ultracentrifugazione ¹⁵ e strategie di etichettatura ^16. Un confronto dettagliato tra il nostro metodo e altri metodi esistenti per la caratterizzazione di proteine ​​di membrana è stata condotta recentemente ^17, ei risultati hanno indicato che il metodo può eseguire altrettanto bene, se nonmeglio, di tutti i metodi rispetto proteomica membrana, ma con una maggiore semplicità.

Per aiutare i ricercatori utilizzano questo metodo, i dettagli qui un protocollo generale. Questo metodo integra diversi vantaggi di strategie glycoproteomics esistenti ed è stato ideato specificamente per glicoproteine ​​di membrana, ma il metodo funziona ugualmente bene per proteine ​​secrete. Le caratteristiche di questo metodo includono: 1) una completa solubilizzazione delle proteine ​​di membrana, 2) un arricchimento di glicopeptidi invece di glicoproteine ​​per eliminare il potenziale sterico quando si usa un substrato solido cattura, 3) l'uso della chimica idrazide per formare legami covalenti tra glicopeptidi e il substrato di cattura, in modo che i glicopeptidi legati possono tollerare lavaggi stringenti per alta glycoselectivity, e 4) la capacità di condurre l'intera procedura di cattura in una provetta per la perdita di campione ridotto e durata procedura abbreviata. Dopo aver implementato questo metodo per studiare una variabileety di campioni biologici comprese le cellule e tessuti, abbiamo osservato una selettività elevata (> 90%) di glicoproteine ^{​​8,17,18.}

Protocol

1. Harvest Membrane Aggiungere tampone ipotonico (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) con cocktail inibitore di proteasi su un pellet di cellule (~ 10 8 cellule) e incubare per 15-30 min in ghiaccio. Lisare le cellule di passare il campione attraverso aghi da siringa (5-10 passaggi) o omogeneizzare il campione da un omogeneizzatore Dounce (15-30 colpi). Utilizzare un emocitometro e trypan colorazione blu per controllare l'efficienza della lisi. Ottenere la fra…

Representative Results

Un diagramma di flusso rappresentante della procedura sperimentale è riassunto nella Figura 1. L'etichettatura e ulteriori fasi di frazionamento sono opzionali e dettagli sono descritti in una recente pubblicazione 18. Un'altra opzione è quella di analizzare i peptidi modificati, che non reagiscono con la resina. I vantaggi di analisi dei peptidi modificati includono una possibile identificazione di peptidi e proteine ​​non glicosilati, come claudine in giunzioni strette; Un ult…

Discussion

Qui vi presentiamo una strategia glicopeptide-capture per il profiling di proteine ​​della superficie cellulare. Il metodo può essere applicato per studiare le proteine ​​secrete, come quelle presenti nel sangue, così come in altri fluidi corporei o in cellule di coltura.

Il successo del metodo si basa sulla digestione completa di campioni; Pertanto, una caratterizzazione SDS-PAGE dell'efficienza digestione è necessario, in particolare per l'analisi prima volta di un campi…

Materials

DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz Hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
Alpha-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755