細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ
Summary
細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。
Abstract
細胞外マトリックスタンパク質を含む細胞表面タンパク質は、例えば、増殖、分化、および増殖などの全ての主要な細胞プロセスおよび機能に関与する。これらのタンパク質の総合的特徴付けは、バイオマーカー探索、細胞型の識別、および薬剤ターゲットの選択だけでなく、細胞生物学や生理学の我々の理解を進めるために支援するための豊富な情報を提供します。表面タンパク質は、しかし、本質的に低いため、その存在量、高い疎水性、及び重翻訳後修飾のため、有意な分析的な課題を提起する。表面タンパク質に普及してグリコシル化を利用して、我々はここでいくつかの既存のN-グライコ手段の利点を統合し、高スループット糖ペプチド捕獲アプローチをご紹介します。本手法は、表面タンパク質由来の糖ペプチドを豊かにし、LC-MSを用いて容易なプロテオミクスのために彼らのグリカンを削除することができます。解決のN-glycoproteomeはINFと、タンパク質の同一性および量だけでなく、糖鎖付加の自分のサイトのormation。この方法は、癌、幹細胞、および薬物毒性を含む領域における一連の研究に適用されている。この方法の限界は、試料の比較的多量のサイトゾルタンパク質を中心に研究と比較してこの分析のために必要とされるように、表面膜タンパク質、低存在量である。
Introduction
細胞表面タンパク質は、細胞外環境と相互作用し、細胞の外側から内側への信号を中継する。従って、細胞外マトリックスタンパク質を含む、これらのタンパク質は、増殖、成長、移動、分化などから老化及び範囲細胞生物学及び生理学の全ての局面において重要な役割を果たす。表面タンパク質は、他の細胞、タンパク質および小分子3と相互作用することによって機能する。薬物の60％以上が細胞表面タンパク質4を標的とするような細胞表面タンパク質の分子特徴付けは、生物学者のためだけでなく、製薬会社のためだけでなく、非常に興味深い。
タンデム質量分析（MS）は、その優れた感度、精度、およびタンパク質およびペプチドの同定のためのスループットで、グローバルプロテオミクス研究5,6のための強力なツールとなっている。しかし、表面タンパク質として、MSに基づくプロテオミクスの重要な課題を提起ほとんどの表面タンパク質は、低量で重い変形が存在する。表面タンパク質の膜貫通領域は、それらを疎水性;これは、特にマルチパス膜貫通タンパク質の場合である。これは、界面活性剤の助けを借りずに、水溶液中の膜タンパク質を溶解することが困難である;しかし界面活性剤の使用は一般的にタンパク質の同定において、HPLCとMS 1,7,8の性能を抑制します。したがって、膜タンパク質が不十分直接LC-MSベースのプロテオミクスに特徴付けられている。
グリコシル化は、細胞表面タンパク質9で行われている最も重要かつ豊富な翻訳後修飾の一つである。グリカンの膨大な複雑さと不均一性は、ペプチドのMSシグナル10を妨げる。それにもかかわらず、いくつかのプロテオミクスの方法は、表面タンパク質を濃縮する前LC-MS分析にタンパク質から糖部分を除去するために、このユニークな変形例を使用している。これらの方法Sは、レクチンベースの親和性捕捉11とヒドラジド系、ホウ酸系化成キャプチャ12と同様に親水性クロマトグラフィー分離8,13が含まれています。グリカンの除去は、通常のタンパク質に膜タンパク質を変換し、劇的に、MSの特性評価を簡素化します。グリコシル化はまた、膜タンパク質とは対照的に、高い溶解性を有する分泌タンパク質で起こるので、多くのglycoproteomic方法は、可溶性タンパク質用に最適化され、膜タンパク質8,14に配備されたときに低い糖ペプチドの選択性および感度を有する傾向がある。他の方法も豊かにするために存在し、特に、超遠心分離15および標識戦略16を用いたものなどの細胞表面タンパク質。膜タンパク質を特徴付けるための手法や他の既存の方法の間の詳細な比較は最近17を実施し 、その結果は我々の手法は、同様に良好に実行できることが示され、もしされませんでしたすべて比べ膜プロテオミクス方法よりも、より良い、より高いシンプルさ。
研究者はこのメソッドを使用しやすくするため、ここでは詳細に一般的なプロトコル。この方法は、既存のグライコ戦略のいくつかの利点を統合し、膜糖タンパク質のために特別に考案されて、まだ方法は、分泌タンパク質についても同様に動作します。この方法の特徴は、1）膜タンパク質の完全な可溶化は、2）の代わりに固体撮像基板を用いた場合、潜在的な立体障害を排除する糖タンパク質の糖ペプチドの濃縮は、3）ヒドラジド化学の使用は、共有結合との間を形成すること結合したグリコペプチドは、高glycoselectivityためのストリンジェントの洗浄に耐えることができ、4）能力が減少したサンプルの損失短縮手順の持続時間のために一本のチューブにキャプチャ全体の手順を実施するように、糖ペプチドおよび撮像基板。変数を研究するためにこのメソッドを実装した後細胞及び組織を含む生物学的試料のETY、我々は、糖タンパク質8,17,18に対して高い選択性（> 90％）を観察した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、細胞表面タンパク質のプロファイリングのためのグリコペプチド捕獲戦略をご紹介します。この方法は、血液中、ならびに他の体液中または細胞培養培地中のもののような分泌タンパク質を研究するために適用することができる。
この方法の成功は、サンプルの完全消化に依存しています。従って、消化効率のSDS-PAGEの特徴付けは、特に、試料を初めて分析の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、サイモンフレーザー大学のスタートアップ資金によって支えられてきた。
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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