Glykopeptider Capture för cellytan Proteomics
Summary
Cellyteproteiner är biologiskt viktiga och ofta glykosylerade. Vi presenterar här en glykopeptid-capture metod för att lösa, berika och deglycosylate dessa proteiner för facile LC-MS-baserad proteomik analyser.
Abstract
Cellyteproteiner, inklusive extracellulära matrisproteiner, delta i alla större cellulära processer och funktioner, till exempel tillväxt, differentiering och proliferation. En omfattande karakterisering av dessa proteiner ger rik information till biomarkörer, cell-typ identifiering, och drog-mål val, samt hjälpa till att förbättra vår förståelse av cellbiologi och fysiologi. Ytproteiner emellertid utgöra betydande analytiska utmaningar på grund av deras inneboende låga överflöd, hög hydrofobicitet, och tunga posttranslationella modifieringar. Med utnyttjande av den förhärskande glykosylering på ytproteiner, introducerar vi här en hög genomströmning glykopeptid-capture strategi som integrerar fördelarna med flera befintliga N-glycoproteomics medel. Vår metod kan berika glykopeptiderna härrör från ytproteiner och ta bort deras glykaner för facile proteomik som använder LC-MS. Det beslutade N-glycoproteome omfattar information av protein identitet och kvantitet samt deras platser för glykosylering. Metoden har tillämpats på en rad studier inom områden som cancer, stamceller, och läkemedelstoxicitet. Begränsningen i metoden ligger i den låga förekomsten av yt-membranproteiner, så att en relativt stor mängd prover krävs för denna analys jämfört med studier inriktade på cytosoliska proteiner.
Introduction
Cellyteproteiner interagera med den extracellulära miljön och vidarebefordra signaler från utsidan till insidan av en cell. Således är dessa proteiner, innefattande extracellulära matrisproteiner, spela kritiska roller i alla aspekter av cellbiologi och fysiologi i intervallet från proliferation, tillväxt, migration, differentiering mot åldring och så vidare. Ytproteiner fungera genom interaktion med andra celler, proteiner och små molekyler 1-3. Molekylär karakterisering av cellytan proteiner är av stort intresse inte bara för biologer utan även för läkemedelsföretag, eftersom mer än 60% av läkemedel är riktade till cell-ytproteiner 4.
Tandem-masspektrometri (MS), med dess överlägsna känslighet, noggrannhet och genomströmning för identifiering av proteiner och peptider, har varit ett kraftfullt verktyg för globala proteomikstudier 5,6. Ändå ytproteiner utgöra betydande utmaningar för MS-baserad proteomik, somflesta ytproteiner finns i små mängder och med tunga modifikationer. De membranöverbryggande regionerna av ytproteiner göra dem hydrofoba; detta är särskilt fallet för flerstransmembranproteiner. Det är sålunda svårt att lösa membranproteiner i vattenhaltiga lösningar utan hjälp av en detergent; Men användningen av tvättmedel trycker allmänhet prestanda HPLC och MS 1,7,8 i proteinidentifiering. Därför har membranproteiner varit dåligt kännetecknas av direkta LC-MS-baserade proteomik.
Glykosylering är en av de viktigaste och mest överflödande posttranslationella modifieringar som sker i cellyteproteiner 9. Den enorma komplexitet och heterogenitet glykaner hämmar peptider "MS-signalen 10. Ändå har flera proteomik metoder används denna unika modifikation att berika ytproteiner och att ta bort sockerdelar från proteiner före LC-MS-analys. Dessa metods inkluderar lektin-baserade affinitet capture 11 och hydrazid-eller borsyra-baserade kemiska capture 12 samt hydrofila kromatografiska separationer 8,13. Avlägsnandet av glykaner förvandlar membranproteiner till vanliga proteiner och drastiskt förenklar MS karakterisering. Eftersom glykosylering sker även i utsöndrade proteiner som har hög löslighet i motsats till membranproteiner, är många glycoproteomic metoder optimerade för lösliga proteiner, och tenderar att ha lägre glykopeptid selektivitet och känslighet när utplaceras till membranproteiner 8,14. Andra metoder finns också för att berika, särskilt cellytan proteiner, till exempel de som använder ultracentrifugering 15 och märkningsstrategier 16. En detaljerad jämförelse mellan vår metod och andra befintliga metoder för karakterisering av membranproteiner fördes nyligen 17, och resultaten visade att vår metod kan utföra lika bra, om intebättre än alla de jämförda membran proteomik metoder, men med högre enkelhet.
För att hjälpa forskare använder denna metod, vi detalj här en allmän protokoll. Metoden integrerar flera fördelar med befintliga glycoproteomics strategier och är utformade specifikt för membranglykoproteiner, men metoden fungerar lika bra för utsöndrade proteiner. Egenskaperna hos denna metod är: 1) en fullständig solubilisering av membranproteiner, 2) en anrikning av glykopeptider istället av glykoproteiner för att eliminera den potentiella steriska hinder vid användning av ett fast infångnings substrat, 3) användningen av hydrazid kemi för att bilda kovalenta bindningar mellan glykopeptider och den infångande substrat, så att de bundna glykopeptider kan tolerera stringenta tvättar för hög glycoselectivity, och 4) förmåga att genomföra hela infångningsförfarande i ett rör för reducerad förlust provet och förkortade förfarande varaktighet. Efter genomförandet av denna metod för att studera en variabelhället av biologiska prover, inklusive celler och vävnader, observerade vi en hög selektivitet (> 90%) till glykoproteiner 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett glykopeptid-capture strategi för profilering cell-ytproteiner. Förfarandet kan tillämpas för att studera utsöndrade proteiner, såsom de i blod, såväl som i andra kroppsvätskor eller i cellodlingsmedia.
Framgången med den metod förlitar sig på fullständig digerering av prover; därför är en SDS-PAGE-karakterisering av matsmältning effektivitet nödvändig, särskilt för förstagångs analys av ett prov. En fullständig nedbrytning kan vara en utmaning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har fått stöd av startfonden av Simon Fraser University.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
