एक शल्य चिकित्सा पद्धति नवजात शिशु चूहों में उदर खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए वर्णित है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग यह anesthetized पिल्ले की brainstem में तीव्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और दो photon माइक्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक कपाल – उच्छेदन को खोलने के लिए संभव है.
vivo में प्रयोगों के लिए एक कपाल – उच्छेदन के उपयोग वयस्कता में स्तनधारी मस्तिष्क में और विकास के दौरान विविध सेलुलर प्रक्रियाओं की गतिशीलता की जांच के लिए एक अवसर प्रदान करता है. अधिकांश में विवो दृष्टिकोण पृष्ठीय पक्ष पर स्थित मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए एक कपाल – उच्छेदन उपयोग हालांकि, इस तरह के उदर पक्ष पर स्थित पोंस के रूप में brainstem क्षेत्रों अपेक्षाकृत understudied रहते हैं. इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य वे electrophysiological और इमेजिंग तरीकों का उपयोग vivo में अध्ययन किया जा सकता है, ताकि उदर brainstem संरचनाओं के लिए उपयोग की सुविधा है. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है संरचनात्मक लंबी दूरी axons में परिवर्तन, एकल में बिजली की गतिविधि के पैटर्न और कोशिकाओं की टुकड़ियों, और नवजात शिशु जानवरों में रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में परिवर्तन का अध्ययन. इस प्रोटोकॉल नवजात शिशु चूहों में श्रवण brainstem अध्ययन करने के लिए ज्यादातर इस्तेमाल किया गया है, यह आसानी से ऐसे नवजात शिशु चूहों, वयस्क Roden के रूप में अन्य कृंतक प्रजातियों में पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकताटीएस और अन्य brainstem क्षेत्रों के.
प्रतिदीप्ति इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक के साथ संयोजन में एक कपाल – उच्छेदन के उपयोग की अनुमति देता निगरानी रक्त प्रवाह, रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता और जीवित पशुओं 1-3 में न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की गतिविधि को मापने. कई प्रयोगशालाओं स्वस्थ और बीमारी की स्थिति में मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, लेकिन अंतराल इन प्रक्रियाओं के विकास के दौरान पैदा की हमारी समझ में रहते हैं. इसके अलावा, सबसे अध्ययन विविध शारीरिक भूमिकाओं के साथ उदर brainstem संरचनाओं पूर्व vivo दृष्टिकोण का उपयोग ज्यादातर अध्ययन किया गया है, ऐसी है कि आसानी से खोपड़ी के पृष्ठीय सतह से सुलभ हैं कि मस्तिष्क क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया है.
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य कृन्तकों के उदर खोपड़ी पर एक कपाल – उच्छेदन खोलने के लिए एक विधि प्रदान करना है. यह दृष्टिकोण इस तरह के संवेदी तंत्रिका तंत्र का शरीर सिफारिश के लिए कुत्तों और बिल्लियों के रूप में बड़ा स्तनधारियों में प्रदर्शन क्लासिक पढ़ाई से लिया गया थाश्रवण brainstem 4-7 की rdings. इस प्रोटोकॉल में हालांकि, नवजात शिशु जानवरों में प्रक्रिया के प्रदर्शन के उपन्यास चुनौती है. Vasculature स्थलों का उपयोग करना, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल नवजात शिशु चूहों, वयस्क चूहों और अवर जैतून 8-11 (चित्रा 1) जैसे अन्य brainstem क्षेत्रों के श्रवण brainstem अध्ययन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है.
उदर brainstem नाभिक अध्ययन करने के लिए मौजूदा तरीकों पर एक उदर कपाल – उच्छेदन का मुख्य लाभ यह है कि जानवरों में रहने वाले ब्याज की संरचनाओं के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, बेहतर वर्तुलिका परिसर का श्रवण कोशिकाओं जांच की लक्षित प्लेसमेंट के लिए और इमेजिंग गहराई से 0.5 मिमी तक सीमित किया जा सकता है, जिसमें दो photon इमेजिंग तरीकों का उपयोग कर के लिए महत्वपूर्ण है जो मस्तिष्क की सतह से micrometers के कुछ दसियों स्थानीयकृत हैं प्रकाश ऊतक बिखरने और अवशोषण. एक उदर कपाल – उच्छेदन यह भी क, अपेक्षाकृत बरकरार तंत्रिका कनेक्शन के साथ एक तैयारी प्रदान करता हैआईसीएच तीव्र और organotypic टुकड़ा तैयारी 12 में बाधित कर रहे हैं. Vivo में Neurophysiology प्रयोगों 13 के लिए अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत, एक उदर दृष्टिकोण बहु इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और सेलुलर टुकड़ियों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं कि इमेजिंग तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है (6 आंकड़े और 7). अन्त में, इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में एक fluorescently लेबल घुला हुआ पदार्थ घुला हुआ पदार्थ के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में परिवर्तन (8 चित्रा) को मापने के लिए vasculature में इंजेक्ट किया जा सकता है.
समय महत्वपूर्ण है. एक अनुभवी शोधकर्ता (1-3 कदम) 1 घंटे में इस प्रोटोकॉल को पूरा करने में सक्षम होना चाहिए. विभिन्न चरणों के लिए कहा गया है बार विशेषज्ञता का एक उच्च स्तर के लिए एक माध्यम मान. गरीब वेंटिलेशन नियंत्रण जानवर की asphyxiation और मौत का कारण हो सकता है के बाद से उचित और समय पर ट्रेकिआटमी और इंटुबैषेण, महत्वपूर्ण हैं. गलतियों जानवर की अनियंत्रित खून बह रहा है और मौत का कारण हो सकता है क्योंकि मांसपेशियों और वसा ऊतकों की सावधानी से मंजूरी भी बहुत महत्वपूर्ण है. Canula प्रविष्टि के लिए मन्या धमनी की तैयारी इसी प्रकार, जब एक धागा गाँठ ढीला हो जाता है अगर अनियंत्रित रक्तस्राव जगह ले जाएगा, ध्यान से धमनी कसने और कटौती की जरूरत है. अन्त में, कपाल – उच्छेदन vasculature स्थलों में खलल न डालें बिना, सावधानी से किया जाना चाहिए. बाहरी तानिका संबंधी परत (ड्यूरा) के लापरवाह हटाने गंभीर खून बह रहा है और धमनियों की आपूर्ति का नुकसान हो सकता है.
वेंटिलेशन सेटिंग्स जानवर की उम्र के हिसाब से चुना जाता है.अधिकांश व्यावसायिक आपूर्तिकर्ताओं में ऐसी स्थितियों के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं. P15 से अधिक उम्र के चूहों में प्रयोगों एक बड़े जानवर वेंटीलेटर के उपयोग की आवश्यकता होगी. वयस्क जानवरों ketamine / xylazine साथ anesthetized अगर वेंटिलेशन की जरूरत नहीं है, लेकिन इंटुबैषेण श्वासनली में प्रवेश तरल पदार्थ से बचने के लिए सिफारिश की है.
इस प्रोटोकॉल का एक मुख्य सीमा प्रयोगों ही तीव्रता से किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में हम दो और दस तक के बीच घंटों तक चलने वाले प्रयोगों का प्रदर्शन किया है. एक दूसरी सीमा प्रयोगों संज्ञाहरण के तहत किया जाना है. इसलिए, संवेदनाहारी की पसंद प्रयोगों की योजना और डिजाइन में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चर रहा है. एक से संबंधित मुद्दे नवजात शिशु जानवरों overdosing के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हो सकता है. उदाहरण के लिए, Ketamine / xylazine मिश्रण को चुन अगर, पिल्ला के वजन के आधार पर खुराक की गणना और अधिकतम मात्रा की ⅓ में दवा प्रशासन. पैर के अंगूठे चुटकी आर से हर 5-10 मिनट जानवर की स्थिति की जाँचesponse. Isoflurane का उपयोग करते हैं, तो सावधानियों भी अन्वेषक (उचित वेंटीलेशन, और एक ठीक से calibrated vaporizer) के लिए एक सुरक्षित वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं.
stereomicroscope दो photon माइक्रोस्कोप के लिए इलेक्ट्रोड और जानवर के स्थानांतरण के लिए जगह देखने के कोण समायोजित करने और अंतरिक्ष निकासी की सुविधा के लिए एक लचीला धारक पर रखा जा सकता है. वेंटीलेटर सत्ता में एक बैटरी का प्रयोग जानवर घूम रहा सुविधाजनक बनाने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के दौरान बिजली कलाकृतियों को कम कर सकते हैं. इस प्रयोजन के लिए एक छोटा सा breadboard (7.5 x 12 इंच) वेंटीलेटर, हीटिंग पैड और anesthetized जानवर (चित्रा 2A) एक साथ इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस स्थापना के लिए एक उपयोगी और महत्वपूर्ण संशोधन सर्जरी के दौरान महत्वपूर्ण संकेत निगरानी के लिए एक उपकरण के अतिरिक्त है. एक oxymeter या अन्य उपकरणों के अनुरूप प्रयोगशाला बजट के आधार पर किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और मुलाकात इमेजिंग के साथ इस्तेमाल किया गया हैपैच दबाना रिकॉर्डिंग 8,10,11, polytrode रिकॉर्डिंग (चित्रा 7), और दो photon इमेजिंग 9 सहित विभागाध्यक्षों, (आंकड़े 6 और 8). एक संभव भविष्य आवेदन electrophysiological रिकॉर्डिंग 16 के लिए fluorescently लेबल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इन तरीकों गठबंधन के लिए किया जाएगा.
नई इमेजिंग आवेदन भी 2 डी या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग 3 डी समय श्रृंखला शामिल हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, brainstem neuronal और glial सेल आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कैल्शियम संकेतकों की सांस में लदान का उपयोग कर. 8 चित्र में दिखाया गया है, एक डाई समाधान मन्या धमनी के माध्यम से रक्त परिसंचरण में इंजेक्शन मस्तिष्क vasculature की उच्च विपरीत छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति डाई microvessel लुमेन भरता है और आसपास के ऊतकों में फैलता है, यह घुला हुआ पदार्थ प्रसार COEF रक्त मस्तिष्क बाधा के स्पष्ट घुला हुआ पदार्थ पारगम्यता की गणना के लिए, लेकिन यह भी न केवल इस्तेमाल किया जा सकता हैमस्तिष्क के ऊतकों 3 में ficient. मन्या धमनी के माध्यम से fluorescently लेबल विलेय इंजेक्शन लगाने के लिए एक मुख्य कारण डाई समाधान सीधे एक पूंछ नस में इंजेक्शन के रूप में पहली बार दिल के लिए जा रहा बिना मस्तिष्क में microvessels के लिए जा सकते हैं. यह कम से कम दो फायदे लाता है. एक छिड़काव दर केन्युलेशन स्थल पर तय हो गई है microvessel लुमेन में प्रतिदीप्ति डाई एकाग्रता व्यावहारिक रूप से स्थिर किया जा सकता है. यह रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता का सही निर्धारण सुनिश्चित करता है. एक और एक परीक्षण एजेंट perfusate में शामिल है, तो यह सीधे शरीर प्रचलन से अन्य कारकों के साथ पतला या संयुक्त किया जा रहा बिना रक्त मस्तिष्क बाधा के लिए जाना जाएगा.
नए प्रयोगों भी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों का लाभ उठा सकते हैं. यह (फ्लोरोसेंट जांच बगल में लोड करने की जरूरत नहीं होगी कि लाभ प्रदान करेगा जब तक प्रयोग के डिजाइनसमय की बचत और संभवतः अधिक बरकरार तैयारी (जैसे कपाल खिड़की 17) की अनुमति के लिए) राज्यों अन्यथा.
अन्त में, प्रयोगों ऐसे अवर जैतून या चेहरे की मोटर नाभिक के रूप में अन्य brainstem क्षेत्रों में किया जा सकता है. किसी दिए गए प्रजातियों में विशिष्ट सेलुलर आबादी की neuroanatomy और विकास के बारे में ज्ञान संरचनात्मक स्थलों जानवरों (चित्रा 1) के बढ़ने के रूप में बदल सकता है, खासकर के रूप में इस अंत की दिशा में महत्वपूर्ण होगा. हम इस प्रोटोकॉल विवो electrophysiological और इमेजिंग तरीकों में उपयोग कर उदर brainstem संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए दूसरों को प्रोत्साहित करने की उम्मीद है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम एनआईएच / NCRR / RCMI से अनुदान G12-RR003060 द्वारा समर्थित किया गया था, न्यू सिटी विश्वविद्यालय से बाल स्वास्थ्य और मानव विकास, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन CBET 0,754,158 और पीएससी CUNY 62337-00 40 की यूनीसे श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट से SC1HD068129 अनुदान न्यूयॉर्क.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |