Un método quirúrgico se describe para exponer el cráneo ventral en ratas neonatas. El uso de este enfoque es posible abrir una craneotomía para llevar a cabo la electrofisiología aguda y experimentos de microscopía de dos fotones en el tronco cerebral de las crías anestesiados.
El uso de una craneotomía para experimentos in vivo proporciona la oportunidad de investigar la dinámica de los diversos procesos celulares en el cerebro de los mamíferos en la edad adulta y durante el desarrollo. Aunque la mayoría de los enfoques en vivo utilizan una craneotomía para estudiar las regiones del cerebro situadas en la cara dorsal, las regiones del tronco cerebral, tales como el puente, situado en la parte ventral siguen siendo relativamente poco estudiada. El principal objetivo de este protocolo es facilitar el acceso a las estructuras del tronco cerebral ventral para que puedan ser estudiados in vivo utilizando electrofisiológico y métodos de imagen. Este enfoque permite el estudio de los cambios estructurales en los axones de largo alcance, los patrones de actividad eléctrica en un solo y conjuntos de células y cambios en la permeabilidad de la barrera de sangre del cerebro en los animales recién nacidos. Aunque este protocolo se ha utilizado sobre todo para estudiar el tronco cerebral auditivo en ratas recién nacidas, que se puede adaptar fácilmente para estudios en otras especies de roedores, como ratones recién nacidos, Roden adultosts y de otras regiones del tronco cerebral.
El uso de una craneotomía en combinación con imágenes de fluorescencia y técnicas de electrofisiología permite el flujo de supervisión de la sangre, la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la medición de la actividad de las neuronas y las células gliales en los animales vivos 1-3. Varios laboratorios han utilizado este enfoque para dar una idea de la fisiología del cerebro en condiciones saludables y las enfermedades, pero persisten lagunas en nuestra comprensión de cómo surgen estos procesos durante el desarrollo. Además, la mayoría de los estudios se han centrado en las regiones del cerebro que son fácilmente accesibles desde la superficie dorsal del cráneo, de tal manera que las estructuras del tronco cerebral ventral con diversas funciones fisiológicas se han estudiado principalmente usando enfoques in vivo ex.
El objetivo principal de este protocolo es proporcionar un método para la apertura de una craneotomía en el cráneo ventral de los roedores. Este enfoque es una adaptación de los estudios clásicos realizados en mamíferos más grandes, tales como perros y gatos para reco neurofisiología sensorialesrdings del tronco cerebral auditivo 4-7. En este protocolo sin embargo, no es la novela reto de realizar el procedimiento en los animales recién nacidos. El uso de puntos de referencia de la vasculatura, este protocolo adaptado se ha utilizado previamente para estudiar el tronco cerebral auditivo de las ratas recién nacidas, ratones adultos y otras regiones del tronco cerebral, como la oliva inferior 8-11 (Figura 1).
Una ventaja principal de una craneotomía ventral sobre los métodos existentes para estudiar núcleos del tronco cerebral ventral es que proporciona acceso directo a las estructuras de interés en animales vivos. Por ejemplo, las células auditivas del complejo olivar superior se localizan unas pocas decenas de micrómetros de la superficie del cerebro, lo cual es importante para la colocación selectiva de sondas y para el uso de métodos de imagen de dos fotones en el que la profundidad de imágenes puede quedar limitada a 0,5 mm por dispersión de tejido ligero y absorción. Una craneotomía ventral también proporciona una preparación con conexiones neurales relativamente intactos, quich se interrumpen en el tramo preparativos agudos y organotypic 12. En contraste con otros protocolos para experimentos in vivo neurofisiología 13, un enfoque ventral se puede combinar con la grabación de múltiples electrodos y los métodos de formación de imágenes que proporcionan información sobre conjuntos celulares (Figuras 6 y 7). Por último, en combinación con este protocolo un soluto marcado de manera fluorescente puede ser inyectado en la vasculatura para medir los cambios en la barrera hematoencefálica permeabilidad al soluto (Figura 8).
El tiempo es crítico. Un investigador con experiencia debe ser capaz de completar este protocolo en 1 hora (pasos 1-3). Los tiempos establecidos para los diferentes pasos se supone un nivel medio o alto de especialización. Traqueotomía y la intubación adecuada y oportuna es fundamental, ya que un mal control de la ventilación puede provocar asfixia y muerte del animal. Aclaramiento cuidadoso de los tejidos musculares y de grasa es también muy importante, ya que los errores pueden conducir a la hemorragia no controlada y la muerte del animal. Del mismo modo, en la preparación de la arteria carótida para la inserción de una cánula, hay que apretar y cortar la arteria cuidadosamente, si el nudo del hilo se afloja la hemorragia no controlada se llevará a cabo. Por último, la craneotomía debe hacerse con cuidado, sin interrumpir su vasculatura hitos. Eliminación descuidada de la capa meníngea externa (duramadre) puede llevar a un sangrado severo y el daño de la irrigación arterial.
Ajustes de ventilación se eligen de acuerdo con la edad del animal.La mayoría de los proveedores comerciales proporcionan información útil acerca de estos ajustes. Experimentos en ratas mayores de P15 requerirán el uso de un gran ventilador para animales. Los animales adultos pueden no necesitar ventilación si anestesiados con ketamina / xilazina, pero se recomienda la intubación para evitar fluido que entra en la tráquea.
Una limitación principal de este protocolo es que los experimentos sólo se pueden realizar de forma aguda. En nuestro laboratorio hemos realizado experimentos que duran entre dos y hasta diez horas. Una segunda limitación es que los experimentos tienen que realizarse bajo anestesia. Por lo tanto, la elección de anestesia es una variable importante a considerar en la planificación y diseño de experimentos. Un problema relacionado es que los animales recién nacidos pueden ser especialmente sensibles a una sobredosis. Por ejemplo, si la elección de la ketamina mezcla / xilazina, calcular la dosis en función del peso de las crías y administrar medicamentos a ⅓ del volumen máximo. Compruebe el estado del animal cada 5-10 minutos en los pies pizca respuesta. Si se utiliza el isoflurano, también es necesario tomar precauciones para mantener un ambiente seguro para el investigador (ventilación adecuada, y un vaporizador calibrado correctamente).
El microscopio estereoscópico se puede montar en un soporte flexible para ajustar el ángulo de visión y facilitar el despacho de espacio para colocar los electrodos y la reubicación del animal para el microscopio de dos fotones. El uso de una batería para alimentar el ventilador puede facilitar el desplazamiento de los animales y reducir los artefactos eléctricos durante los experimentos de electrofisiología. Para este fin, un pequeño tablero (7,5 x 12 pulgadas) se puede utilizar para montar juntos el ventilador, la almohadilla de calefacción y la anestesiado de los animales (Figura 2a). Una modificación útil e importante para esta configuración es la adición de un dispositivo para el seguimiento de los signos vitales durante la cirugía. Un oxímetro u otros dispositivos analógicos pueden ser utilizados en función del presupuesto de laboratorio.
Este protocolo se ha utilizado con la electrofisiología y la imagen se reuniócapachos, incluyendo grabaciones de patch clamp 8,10,11, grabaciones polytrode (Figura 7), y de dos fotones 9 (Figuras 6 y 8). Una posible aplicación futura sería combinar estos métodos para atacar a las células marcadas con fluorescencia para el registro electrofisiológico 16.
Las nuevas aplicaciones de imágenes también pueden incluir 2-D o de series de tiempo 3-D utilizando microscopía de dos fotones. Por ejemplo, el uso de bolo de carga de indicadores de calcio para estudiar la actividad neuronal de tronco cerebral y las poblaciones de células gliales. Como se muestra en la Figura 8, una solución de colorante se inyecta en la circulación de la sangre a través de la arteria carótida se puede utilizar para generar imágenes de alto contraste de la vasculatura del cerebro. Como el colorante de fluorescencia llena el lumen de microvasos y se propaga en el tejido circundante, que puede ser utilizado no sólo para el cálculo de la permeabilidad de solutos aparente de la barrera de sangre del cerebro, sino también el coeficiente de difusión de solutosciente en el tejido cerebral 3. Una razón principal para la inyección de los solutos marcados con fluorescencia a través de la arteria carótida es que la solución de colorante puede ir directamente a la microvasculatura del cerebro sin entrar en el corazón por primera vez como una inyección en la vena de la cola. Esto trae al menos dos ventajas. Una es que la concentración de colorante de fluorescencia en el lumen de microvasos puede ser prácticamente constante si la tasa de perfusión se fija en el sitio de canulación. Esto garantiza una determinación exacta de la permeabilidad barrera sangre-cerebro. Otra es que si un agente de ensayo está incluido en el perfundido, irá directamente a la barrera sangre-cerebro sin ser diluido o combinado con otros factores de la circulación del cuerpo.
Nuevos experimentos también pueden hacer uso de animales transgénicos con los reporteros fluorescentes codificadas genéticamente. Esto proporcionaría la ventaja de que no tendrían que ser cargado in situ de sondas fluorescentes (a menos que el diseño del experimentoafirma lo contrario), el ahorro de tiempo y, posiblemente, lo que permite para las preparaciones intactas más (por ejemplo, ventana craneal 17).
Por último, los experimentos se pueden realizar en otras regiones del tronco cerebral como la oliva inferior o el núcleo motor facial. El conocimiento de la neuroanatomía y el desarrollo de las poblaciones celulares específicas en una determinada especie, será importante para este fin, especialmente en lo puntos de referencia anatómicos pueden cambiar a medida que los animales crecen (Figura 1). Esperamos que este protocolo anima a otros a estudiar las estructuras del tronco cerebral ventral utilizando en electrofisiológicos in vivo y métodos de imagen.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el subsidio G12-RR003060 de NIH / CNRR / RCMI, conceder SC1HD068129 del Instituto Nacional Eunice Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano, la Fundación Nacional para la Ciencia CBET 0.754.158 y PSC-CUNY 62337-00 40 de la City University de Nueva York.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |