En kirurgisk metod beskrivs för att exponera den ventrala skallen på nyfödda råttor. Med hjälp av denna metod är det möjligt att öppna en kraniotomi att utföra akuta elektrofysiologi och två-photon mikroskopi experiment i hjärnstammen på sövda valpar.
Användningen av en kraniotomi för experiment in vivo ger en möjlighet att undersöka dynamiken hos olika cellulära processer i däggdjurshjärnan i vuxen ålder och under utveckling. Även om de flesta in vivo-metoder använder en kraniotomi för att studera hjärnregioner som ligger på ryggsidan, hjärnstammen regioner som pons, som ligger på den ventrala sidan förblir relativt understudied. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att underlätta tillgången till ventrala hjärnstamsstrukturer så att de kan studeras in vivo med hjälp av elektrofysiologiska och avbildningsmetoder. Detta tillvägagångssätt gör studie av strukturella förändringar i långväga axoner, mönster av elektrisk aktivitet i singel och ensembler av celler, och förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet i nyfödda djur. Även om detta protokoll har använts främst för att studera den auditiva hjärnstammen i nyfödda råttor, kan det enkelt anpassas för studier i andra gnagare såsom nyfödda möss, vuxen rodents och andra hjärnstamsregioner.
Användningen av en kraniotomi i kombination med fluorescensavbildning och elektrofysiologiska tekniker medger övervakning blodflöde, blodhjärnbarriären permeabilitet och mätning av aktiviteten av neuroner och gliaceller i levande djur 1-3. Flera laboratorier har använt denna metod för att ge insikt i hjärnans fysiologi hos friska och sjukdomstillstånd, men fortfarande brister i förståelsen av hur dessa processer uppkommer under utveckling. Dessutom har de flesta studier fokuserat på områden i hjärnan som är lätt åtkomliga från den dorsala ytan av skallen, så att ventrala hjärnstamsstrukturer med olika fysiologiska roller har studerats mestadels använder ex vivo metoder.
Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att öppna en kraniotomi på den ventrala skallen av gnagare. Detta tillvägagångssätt var anpassad från klassiska studier på större däggdjur som hundar och katter för sensoriska neurofysiologi recordings av den auditiva hjärnstammen 4-7. I detta protokoll föreligger emellertid den nya utmaningen att utföra proceduren i nyfödda djur. Med hjälp av landmärken kärl har detta anpassat protokoll använts tidigare för att studera den auditiva hjärnstammen av nyfödda råttor, vuxna möss och andra hjärnstams regioner som underlägsna oliv 8-11 (figur 1).
En stor fördel med en ventral kraniotomi över befintliga metoder för att studera ventrala hjärnstamskärnor är att det ger direkt tillgång till de strukturer av intresse i levande djur. Till exempel är hörselcellerna i den överlägsna olivary komplex lokaliserat några tiotals mikrometer från hjärnans yta, vilket är viktigt för riktad placering av sonder och för att använda två-photon avbildning där bilddjupet kan begränsas till 0,5 mm med ljusvävnadsspridning och absorption. En ventrala kraniotomi ger också ett preparat med relativt intakta neurala kopplingar, WHich störs i akuta och organotypic slice förberedelser 12. I motsats till andra protokoll för in vivo neurofysiologi experiment 13, kan kombineras en ventral strategi med multielektrod inspelning och avbildningsmetoder som ger information om cellulära ensembler (figur 6 och 7). Slutligen, i kombination med detta protokoll ett fluorescerande löst ämne kan injiceras i kärlsystemet för att mäta förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet till lösta ämnet (Figur 8).
Tiden är kritisk. En erfaren forskare ska kunna slutföra detta protokoll i 1 timme (steg 1-3). Tiderna som anges för de olika stegen antar en medelhög till hög kompetens. Korrekt och aktuell trakeotomi och intubation är kritiska, eftersom dålig ventilation kontroll kan leda till kvävning och djuret dör. Noggrann clearance av muskel-och fettvävnader är också mycket viktigt eftersom misstag kan leda till okontrollerad blödning och djuret dör. På samma sätt vid upprättandet av halspulsådern för kanyl insättning, måste man dra åt och skära artären försiktigt, om tråden knut lossnar okontrollerad blödning kommer att ske. Slutligen bör kraniotomi göras försiktigt, utan att störa de landmärken kärlbädden. Vårdslös borttagande av det yttre meningeal skikt (dura) kan leda till allvarlig blödning och skada på det arteriella försörjningen.
Ventilationsinställningarna väljs efter djurets ålder.De flesta kommersiella leverantörer ger användbar information om dessa inställningar. Experiment på råttor äldre än P15 kommer att kräva användning av ett stort djur ventilator. Vuxna djur kanske inte behöver ventilation om bedövas med ketamin / xylazin, men intubation rekommenderas att undvika att vätska kommer in i luftstrupen.
En viktig begränsning i detta protokoll är att experiment endast kan utföras akut. I vårt laboratorium har vi utfört experiment som varar mellan två och upp till tio timmar. En andra begränsning är att experiment måste utföras under anestesi. Därför är valet av narkosmedel en viktig variabel att beakta vid planeringen och utformningen av experiment. En annan risk är att nyfödda djur kan vara särskilt känsliga för överdosering. Till exempel, om du väljer ketamin / xylazin mix, beräkna dosen baserat på valpens vikt och administrera läkemedel på ⅓ av den maximala volymen. Kontrollera tillståndet för djuret varje 5-10 minuter från tå nypa response. Om du använder isofluran, skall säkerhetsåtgärder också behövs för att upprätthålla en säker miljö för forskaren (ventilation, och en riktigt kalibrerad förångare).
Den stereomikroskop kan monteras på en flexibel hållare för att justera betraktningsvinkel och underlätta utrymme klare att placera elektroder och flytt av djuret till två-photon mikroskop. Användning av ett batteri för att driva fläkten kan underlätta att flytta djuret och minska elektriska artefakter under elektrofysiologi experiment. För detta ändamål kan en liten kopplingsdäck (7,5 x 12 inches) användas för att montera ihop ventilatorn värmedyna och sövda djur (Figur 2a). En användbar och viktig modifiering av denna inställning är tillägget av en anordning för övervakning av vitala funktioner under kirurgi. En oxymeter eller andra analoga enheter kan användas beroende på laboratoriebudgeten.
Detta protokoll har använts med elektrofysiologi och bildhantering möttestrågen, inklusive patch clamp inspelningar 8,10,11, polytrode inspelningar (figur 7) och två-foton-avbildning 9 (fig 6 och 8). En möjlig framtida applikation skulle vara att kombinera dessa metoder för inriktning fluorescerande celler för elektrofysiologiska inspelning 16.
Nya bildprogram kan också innehålla 2-D eller 3-D tidsserier med hjälp av två-photon mikroskopi. Exempelvis med användning av bolus-lastning av kalcium indikatorer för att studera aktiviteten av hjärnstammen neuronala och gliala cellpopulationer. Såsom visas i fig 8, insprutas en färgämneslösning in i blodcirkulationen genom halspulsådern kan användas för att alstra bilder med hög kontrast av hjärnan vasculature. Eftersom fluorescens färgämne fyller mikrokärllumen och sprider sig in i den omgivande vävnaden, kan den användas inte bara för att beräkna den skenbara upplösta ämnet permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären, utan även det lösta ämnet diffusion coefligt i hjärnvävnaden 3. En viktig anledning till att injicera fluorescerande lösta ämnen via halspulsådern är att färglösningen direkt kan gå till mikrokärl i hjärnan utan att gå till hjärtat först som i en svansveninjektion. Detta medför åtminstone två fördelar. En är att den fluorescerande färgämneskoncentrationen i mikrokärls lumen kan vara praktiskt taget konstant om perfusionshastighet är fast vid kanyle platsen. Detta säkerställer noggrann bestämning av blod-hjämbarriären. En annan är att, om ett testmedel ingår i perfusatet, kommer det att gå direkt till blod-hjärnbarriären utan att bli utspädd eller i kombination med andra faktorer från kroppen cirkulationen.
Nya experiment kan också dra nytta av transgena djur med genetiskt kodade fluorescerande reportrar. Detta skulle ge den fördelen att fluorescerande prober inte skulle behöva laddas in situ (om utformningen av experimentetsäger annat), vilket sparar tid och eventuellt möjliggör mer intakta preparat (t ex skallfönster 17).
Slutligen kan experiment utföras i andra hjärnstamsregioner såsom sämre olivolja eller ansiktsmotorkärnan. Kunskap om neuroanatomi och utveckling av specifika cellpopulationer i en viss art kommer att vara viktigt i detta syfte, särskilt som anatomiska landmärken kan förändras när djuren växer (Figur 1). Vi hoppas att detta protokoll uppmuntrar andra att studera ventrala hjärnstamsstrukturer med hjälp av in vivo-elektrofysiologiska och avbildningsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag G12-RR003060 från NIH / NCRR / RCMI bevilja SC1HD068129 från Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation CBET 0.754.158 och PSC-CUNY 62.337-00 40 från City University i New York.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |