우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Melanoblasts은 멜라닌 세포의 전구체를 파생 신경 문장이다; 피부와 머리카락의 색소를 생산에 대한 책임 세포. Melanoblasts는 이후에 개발 머리가 1,2 여포 식민지 배의 표피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 신경 능선 세포의 이동은 광범위하게 체외에서 연구되고 있지만, 생체 내 방법을 아직 잘 특히 포유류의 시스템에서 개발되지 않습니다. 하나의 대안은 생체의 Organotypic 문화 3-6을 사용하는 것입니다. 마우스 배아 피부 배양 조직 3,6의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면 (ALI)의 유지 보수를 필요로한다. 마우스 배아 피부의 고해상도 라이브 영상이 ALI를 유지뿐만 아니라 문화가 반전 짧은 작동 거리 대물 렌즈와 대부분의 공 초점 현미경 따라서 호환 할 수 있습니다뿐만 아니라 좋은 방법의 부족에 의해 방해되었다. 이 문서에서는 메타에 최신의 향상된 기능에 대해 설명합니다OD 즉, 이러한 문제점을 극복하고 생체 외 배양 6 배아 피부의 고해상도 촛점 이미징을 허용하는 가스 투과 막을 사용한다. melanoblast 특정 크레-재조합 효소가 R26YFPR 기자 라인과 함께 마우스 라인을 표현을 사용함으로써 우리는 형광이 피부의 문화 내에서 melanoblast 인구 레이블을 할 수 있습니다. 이 기술은 수 melanoblasts 자신의 행동과 그들이 개발하는 조직과의 상호 작용을 관찰의 라이브 영상. 대표 결과는 사양에 라이브 이미지를 병렬로 6 문화를 보여주기 위해 포함되어 있습니다.
서론
전통적으로 배아 피부는 마우스 배아에서 해부와 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 뉴 클레오 포어 막에 장착하여 배양하고있다. 멤브레인이어서 따라서 현상 3,4 조직의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지 배지에 부유된다. 이 기술은 조직을 고정하고 마커 7로 β-갈 락토시다 아제를 사용하여 melanoblast 분포를 평가하여 melanoblast 동작을 분석 실험하는 데 사용되었습니다. 우리는 생체 피부의 문화 6 라이브 영상의 형광 표지 melanoblasts 수있는 방법을 개발했습니다. 여기에서 우리는 공 촛점 이미징을 살고, 설정에, 해부에서 세부 방법을 설명하고 최근의 일부 개선을 포함한다.
Melanoblasts은 멜라닌 세포의 배아 전구체, 머리와 피부에 색소를 생산하는 세포입니다. Melanoblasts는 개발 마우스 전자에서 배아 일 9 (E9) 주위에 신경 튜브에 인접한 신경 능선에서 발생mbryo. 그 후 그들은 외배엽 및 개발 somites 사이의 dorsolateral 경로를 따라 이동한다. E12.5에서 그들은 증식과 그들의 이동을 계속 표피 진피에서 이동합니다. 기본 모낭 패턴이 모공을 지역화하는 E14.5에서 표피와 E15.5의 melanoblasts에 의해 형성하기 시작합니다. melanoblast / 멜라닌 세포 개발의 검토를 위해 토마스 에릭슨 (2008) 1을 참조하십시오. melanoblast 인구 레이블을하기 위해 우리는 티르를 결합했다 :: 조건부 ROSA26 궤적 9에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현 R26YFPR 동물과 마우스 티로시나 아제 프로모터 (8)에 의해 구동 크레-재조합 효소를 표현 CREB 동물.
우리는 거꾸로 공 초점 현미경을 사용하여 문화 배아 피부와 캡처 이미지를하는 방법을 설명합니다. 그것은 모트 등의 설명 원래의 방법. (2010) 6 형태로 구성된다. 본방법은 6 자 형식으로 영상을 허용하고 문화를 지원하는 뉴 클레오 포어 막에와 리겔에 대한 의존도를 제거합니다. 대신 배아 피부를 안정화하는 1 % 아가로 오스의 소 블록을 사용. 마트 리겔에 대한 의존도를 제거하면, 특히 수용성 성장 인자에 대한 배아 피부의 반응이 연구의 초점이 상황에서 중요하다. 우리의 원래 방법은 이미 melanoblast 개발 10-13에 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다 그리고 우리는 우리가 여기에서 설명하는 개선이 다수의 병렬 문화가 요구 사항, 특히 실험적인 기술로 더 강력 할 것으로 예상.
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프로토콜
모든 동물의 작업은 영국 홈 오피스 (프로젝트 라이센스 번호 PPL 3천7백85분의 60 및 4천4백24분의 60)에 의해 라이센스하에 제도적 지침에 따라 수행 하였다.
1. 준비
- 형광 기자 마우스 라인과 적절한 크레-재조합 효소 발현하는 마우스 라인을 결합하여 개발 피부에 melanoblasts 레이블을 지정합니다. 티르 :: CREA, 티르 :: CREB 8 Wnt1의 :: 크레 (14) 크레 발현 선으로 성공적으로 사용되었습니다 R26YFPR 9 리포터 라인으로.
- 층류 후드에서 배양액을 준비하고; (1 %의 v / V의 페니실린 / 스트렙토 마이신)와 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 보완, 10 % V / V 소 태아 혈청과 0.584 GM / L의 L-글루타민.
- 라이브 영상 장치는 70 % 에탄올로 닦고하여 영상 실 자료를 소독 그림 1에 설명되어 있습니다. OV 담가 인서트, 촬상 클립, 그리고 O-링을 살균70 % 에탄올에 ernight. 챔버의 뚜껑으로 6 잘 플레이트에서 멸균 뚜껑을 사용합니다.
- 영상 실의 바닥면은 O-링 (그림 1)에 의해 고정 움직임이 둔한 뚱뚱 막으로 구성되어 있습니다. 35mm의 가스 투과 움직임이 둔한 뚱뚱 요리와 함께 시작합니다. 영상 실에 접시를 놓고 하나의 에지 면도날 가스 투과 막 잘라. 영상 실에 고정 막에 O-링을 밀어 넣습니다.
- 영상 클립 (총 6) 대신에 배아 피부에 사용하기 전에 1 % 아가로 오스로 가득해야합니다 (그림 1) 클램프. C.를 레인지 작동 60 °로 냉각에 의해 멸균 dH보다 2 O와 아가로 오스의 2 % 용액을 제조 10 ㎖의 배지와 혼합 1:1 (2 단계 참조) 60 ℃로 예열 멸균 6 잘 플레이트에 6 영상 클립을 서있다. 좋은 pastette를 사용하여 각 클립의 가운데에 1 % 아가로 오스 솔루션에 떨어져 냉각 할 수 있습니다. 을 방지하기 위해 각 웰에 1 ㎖ 차가운 멸균 PBS를 추가마르지 garose. 영상 클립은 PBS에서 몇 시간 동안 저장 될 수있다.
- 배아 피부의 섬세한 분리를 수행하고 대신 대나무 케밥 꼬치 사용할 수있는 젓가락을 사용하는 카시와기 등. 3에 설명 된대로 해부 조직의 머리 스틱 방식 '을 사용하여 처리 할 수 있습니다. 단일 양날 면도날을 사용하여 꼬치의 평평한 끝의 작은 틈새를 확인하고 강모 부드러운 칫솔을 삽입합니다. 그것의 길이는 약 15 cm입니다 있도록 꼬치 트림.
- 전체 환경 챔버와 공 초점 현미경을 사용하거나 공기에서 5 % CO 2를 제공하는 최고 챔버를 준비. 이전 영상에 적어도 1 시간 동안 37 ° C로 현미경 무대를 Prewarm. 이것은 그들이 워밍업으로 무대 구성 요소의 확장으로 인한 샘플 드리프트를 방지하는 데 도움이됩니다.
- 한 빠르고 쉽게 실험적를 설정하는 각 문화의 중간에 중심을 할 수 있도록 현미경의 제어 소프트웨어를 사용하여 다중 위치 세트를 준비t.
2. 절차
- 마우스 메이트와 일 E0.5로 첫날 포스트 교미를 지정합니다. 하루 E14.5에서 경추 탈구하여 여성을 추려하고, 작은 정중선 절개 머리와 꼬리쪽으로 피부를 제외한 당기는 후 내부 복막 절단 백 몸체의 양쪽에 pealing 의해 체강을 노출. 집게로 단단히 잡고 수술 가위를 사용 mesometrium 따라 자르는 추위 멸균 PBS로 자궁을 해부하다. 필요한 때까지 얼음에 자궁을 유지합니다. 자세한 설명은 시어 외. (2007 년) 15를 참조하십시오.
- 먼저 미세 집게 두 쌍을 따로 잡아 당겨 탈락을 해제 수술 가위로 자궁 벽의 길이를 절단하고 탈락의 배아를 해부하여 자궁에서 배아를 해부하다. 형광 기자의 표현 (필요한 경우)에 대한 화면입니다.
- 해부하기 전에 잘린 배아를 추려. 잠수정equently 꼬리를 제거하여 단일 에지 면도날을 사용하여 손발 후 앞다리 뒷다리. 필요한 경우 유전자형에 대한 조직을 유지.
- rostro - 꼬리 방향으로 중간 선 부근에 ventrum에 절개를합니다. 단계 1.6에 기재된 헤어 스틱을 사용하여 조심스럽게 동시에 배아 회전 내부 결합 조직으로부터 피부를 멀리 애타게. 피부를 완전하게 제거하는 것이 아니라 첫 번째 절개의 복부 가장자리 멀리 함께 첨부 해 두지 마십시오.
- 그것은 다음 마운트하기가 매우 어렵 기 때문에가 피부를 망쳐하게하지 않는 것이 중요합니다. 이를 방지 건조 페트리 접시의 표면에 헤어 스틱 (피부 측까지)를 이용하여 피부를 평평하고 하나 양날 면도날을 사용하여 얻어 배아 줄기에서 배기판. 피부는 제거되기 전에 피부 측 해부 조직 및 배아의 접합부의주의 관찰에 의해 표피 측으로부터 구별 될 수있다. 해부 조직의 영역입니다약 0.5 mm 2 E14.5 배아를 해부 할 때.
- 아가로 오스는 조직의 피부면을 만지지 않도록 피부의 상단에 영상 클립을 놓습니다. 클립의 측면까지 조직의 가장자리를 애타게 신중하게 다음 60 초 동안 서서 할 수 있습니다. 클립을 거꾸로하고 머리 피부를 평평하게하고 가능한 한 적게 (이미지를 만들 영역에서) 조직의 표면을 만지지주의하면서 공기 방울을 제거하기 위해 스틱 사용합니다.
- 그들은 조이도록 촬상 클립의 양쪽에 두 개의 단순 엄지 매듭을 이용한 영상 클립에 피부를 매고 클립의 상단 부근에 홈에 피부를 당겨 실크 봉합사 실을 사용. 클립을 반전, 이미지 삽입 및 자료의 장소 안에 밀어 넣습니다. (단계 1.2 참조) 배지 ~ 5 ㎖로 삽입을 입력합니다. 그림 1은 영상 실의 어셈블리를 설명합니다.
- 나머지 5 샘플에 대한 프로토콜을 반복합니다.
3. 라이브영상
- 이미징 챔버는 표준 6 - 웰 플레이트와 같은 크기를 가지고 있습니다. 공 초점 현미경의 무대에 챔버를 탑재 적절한 플레이트 인서트를 사용합니다.
- 자동화 된 단계는 병렬 문화가 이미지에 필요합니다. 공 초점 소프트웨어 이미지까지 6 위치를 정의합니다. 정확한 설정이 사용 현미경의 능력에 의존 할 것이다. 일반적으로 작은 Z-스택 (3-5 Z-위치가 어느 단계 드리프트를 고려하여) 6 각 위치에서 사용되며, Z-스택은 18 ~ 24 시간 동안 매 2 분을 캡처됩니다. 라이브 - 이미징 애플리케이션에 레이저 전력 및 요구 Z-섹션들의 개수를 감소시키기 위해 광학적으로 최적의 핀홀 설정보다 더 넓게 사용하는 것이 일반적으로 유리하다.
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결과
그림 2는 티르에서 배아의 피부를 사용하여 시간 경과 실험에서 대표적인 결과를 보여줍니다 :: CREB는 E14.5에서 R26YFPR 배아를 x. 6 배아 피부의 문화는 18 시간 동안 매 2 분 공 초점 현미경으로 몇 군데 있었다. 프리웨어 이미지 분석 소프트웨어 패키지는 ImageJ에 6 영화 YFP - 표지 melanoblasts의 행동을 분석하는데 사용 하였다. melanoblasts 자동 (제스퍼 Søndergaard이 페더슨에 의해 개발 된 wrMTrck 플러그인을 사용하여 추적했다 http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html 1-3 실험의 대표입니다. 영화) 추적 결과는 그림 2에 표시되어 패널에 대응하고 G. 그들은 각각...
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토론
우리는 거꾸로 공 초점 현미경에하는 라이브 세포 이미징 의무 특수성이다 문화 배아 피부에하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 6 문화가 병렬로 몇 군데 리겔 원래의 방법 (6)의 뉴 클레오 포어 막에 대한 의존도를 제거 할 수 있도록 최근의 개선 사항이 포함되어 있습니다. 유사한 기술에서 중요한 기술적 인 차이는 공기 액체 계면을 확립하고 또한 커버 슬립 역할을 가스 투과성 움직임이 둔한 뚱뚱 멤브레인의 사용이다. 우리는 성공적으로 최대 48 시간 동안 연속 공 촛점 이미징과 문화를 유지하고있다. 공 촛점 이미지의 노이즈 비율은 높은 해상도와 뛰어난 신호는 자동 세포 추적 결과 시간 경과 영화에서 melanoblast 동작을 분석 할 수 있습니다.
이 기술을 사용하면 그것은 melanoblast 분산의 역학 조사 및 표피와 현상 모낭과의 상호 작용을 연구하는 것이 가능하다. 중요한 성프로토콜의 EPS는 개발 표피를 손상하지 않고 단점을 보완 또는 뻗어없이...
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 연구는 의학 연구위원회에서 핵심 기금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 도면을 준비 크레이그 니콜에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 영상 지원을위한 마태 복음 피어슨와 폴 페리에게 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM 고포도당 | Biochrom AG | F0475 | 페놀 레드 |
| 페니실린 | 시그마 | P3032 | |
| 스트렙토마이신 | 시그마 | S9137 | |
| 태아 송아지 혈청 | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| 에탄올 | 제네릭 | ||
| 라이브 이미징 챔버 | 맞춤형 | ||
| Lummox 접시 | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6웰 플레이트 | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| 단면 면도날 | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic PBS | ||
| 일반 | |||
| 케밥 꼬치 | Waitrose | 대나무 바베큐 꼬치 30cm | |
| 칫솔 | 일반 | ||
| 페트리 접시 | Greiner Bio-One | 633185 | |
| 봉합사 | 실 보기 | SP115 | 블랙 실크 봉합사 |
참고문헌
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