Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración
Summary
Se describe la disección y el cultivo ex vivo de la piel del ratón embrionario. El sistema de cultivo mantiene una interfase aire-líquido a través de la superficie del tejido y permite formación de imágenes en un microscopio invertido. Melanoblastos, un componente de la piel en desarrollo, están marcados con fluorescencia que permite su comportamiento que debe observarse mediante microscopía confocal.
Abstract
Melanoblastos son la cresta neural precursoras de melanocitos derivados; las células responsables de la producción de pigmento en la piel y el cabello. Melanoblastos migran a través de la epidermis de embrión donde posteriormente colonizan el cabello folículos en desarrollo 1,2. Neural migración celular cresta se estudió extensamente in vitro, pero los métodos in vivo todavía no están bien desarrollados, sobre todo en los sistemas de mamíferos. Una alternativa es utilizar ex vivo cultivo organotípico 3-6. Cultura de ratón de la piel embrionaria requiere el mantenimiento de una interfase aire-líquido (ALI) a través de la superficie del tejido 3,6. De alta resolución en vivo de imágenes de ratón de la piel embrionaria se ha visto obstaculizada por la falta de un buen método que no sólo mantiene este ALI sino que también permite la cultura a ser invertida y por lo tanto compatible con distancia de trabajo corta lentes de objetivo y microscopios confocales más. Este artículo describe las mejoras recientes a una metanfetaminadesde que utiliza una membrana permeable a los gases para superar estos problemas y permitir de alta resolución de imagen confocal de la piel embrionaria en cultivo ex vivo 6. Mediante el uso de un melanoblasto Cre-recombinasa específica expresando línea de ratones combinado con la línea reportero R26YFPR podemos etiquetar con fluorescencia la población melanoblasto dentro de estos cultivos de piel. La técnica permite vivir de imágenes de melanoblastos y la observación de su comportamiento y las interacciones con el tejido en el que se desarrollan. Los resultados representativos se incluyen para demostrar la capacidad de vivir-image 6 cultivos en paralelo.
Introduction
Tradicionalmente la piel embrionaria se ha cultivado mediante la disección de la embrión de ratón y de montaje sobre una membrana de policarbonato Nuclepore. La membrana se hace flotar entonces en medio de cultivo, manteniendo así una interfaz aire-líquido a través de la superficie del tejido en desarrollo 3,4. Esta técnica ha sido utilizada para someter a ensayo el comportamiento melanoblasto mediante la fijación del tejido y la evaluación de la distribución melanoblasto utilizando β-galactosidasa como marcador 7. Hemos desarrollado un método que permite melanoblastos de imágenes en directo de la etiqueta fluorescente en ex vivo cultivo de piel 6. A continuación se describe el método en detalle de la disección, para configurar, para vivir de imagen confocal y se incluyen algunas mejoras recientes.
Melanoblastos son los precursores embrionarios de los melanocitos, las células que producen el pigmento en el cabello y la piel. Melanoblastos surgen en la cresta neural adyacente al tubo neural en torno al día embrionario 9 (E9) en el ratón en desarrollo embryo. Posteriormente que migran a lo largo de una vía dorsolateral entre el ectodermo y los somitas en desarrollo. En E12.5 se mueven de la dermis a la epidermis, donde proliferan y continúan su migración. El patrón folículo piloso primaria comienza a formarse en la epidermis en E14.5 y E15.5 por melanoblastos están localizando a estos folículos. Para una revisión del desarrollo melanoblasto / melanocito ver Thomas & Erickson (2008) 1. Con el fin de etiquetar la población melanoblasto hemos combinado Tyr :: animales CREB que expresan Cre-recombinasa impulsado por el promotor de la tirosinasa de ratón con 8 animales R26YFPR que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) condicionalmente desde el locus ROSA26 9.
Se describe un método para la piel y la captura de imágenes de cultivo de embriones utilizando un microscopio confocal invertido. Se forma el método original descrito en Mort et al. (2010) 6 está adaptada. La presentemétodo permite formación de imágenes en un formato de 6 pocillos y se elimina la dependencia de las membranas Nuclepore y en Matrigel para apoyar la cultura. En lugar usando un pequeño bloque de agarosa al 1% para estabilizar la piel embrionaria. Extracción de la dependencia de Matrigel es importante, especialmente en situaciones en las que la respuesta de la piel embrionaria a factores de crecimiento solubles es el foco de estudio. Nuestro método original ya se ha utilizado para obtener nuevos conocimientos sobre el desarrollo melanoblasto 10-13 y esperamos que las mejoras que describimos aquí se hacen más potente como una técnica experimental especialmente cuando múltiples culturas paralelas son un requisito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un método para la cultura de la piel embrionaria que es particularidad susceptible imágenes de células vivas que en microscopios confocal invertido. El método incluye las recientes mejoras que permiten a los 6 cultivos para obtener imágenes en paralelo y elimina la dependencia de matrigel y membranas Nuclepore del método original 6. La diferencia técnica fundamental de técnicas similares es el uso de una membrana permeable a los gases lummox para establecer una interfaz aire-líquido y tam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por la financiación básica del Consejo de Investigación Médica. Estamos muy agradecidos a Craig Nicol para preparar los dibujos técnicos. Estamos muy agradecidos a Mateo Pearson y Paul Perry por su apoyo de imágenes.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. 발생학. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. 발생학. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. 발생학. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
