Induite par laser Répartition Spectroscopy: Une nouvelle approche pour la cartographie et la quantification de nanoparticules dans les tissus d'organes
Summary
Spectroscopie par claquage induit par laser effectués sur organe mince et le tissu tumoral a détecté avec succès des éléments naturels et gadolinium injecté artificiellement (Gd), émises à partir de nanoparticules à base de Gd. Images d'éléments chimiques ont atteint une résolution de 100 um et de la sensibilité quantitative sous-mM. La compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel pour fournir de multiples images d'un même tissu biologique.
Abstract
spectroscopie d'émission de plasma induit par laser a été appliqué à l'analyse élémentaire d'échantillons biologiques. Spectroscopie de rupture induite au laser (LIBS) effectuée sur des coupes minces de tissus de rongeurs: les reins et tumorales, permet la détection des éléments inorganiques tels que (i) Na, Ca, Cu, Mg, P et Fe, naturellement présente dans le corps et (ii) Si et D.ieu, détectés après l'injection de nanoparticules à base de gadolinium. Les animaux ont été euthanasiés 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules. Un balayage en deux dimensions de l'échantillon, effectuée en utilisant un micrométrique 3D-platine motorisée, laisse le faisceau laser infrarouge à explorer la surface avec une résolution latérale inférieure à 100 μ m. Images chimique quantitative de D.ieu élément intérieur de l'organe ont été obtenus avec la sensibilité sous-mM. LIBS est une méthode simple et robuste pour étudier la distribution de matériaux inorganiques sans labeli spécifiqueng. En outre, la compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel à fournir de multiples images de la même tissu biologique avec différents types de réponse: élémentaire, moléculaires ou cellulaires.
Introduction
Le large développement de nanoparticules pour des applications biologiques exhorté l'amélioration parallèle de techniques analytiques pour leur quantification et de l'imagerie dans des échantillons biologiques. Habituellement, la détection et la cartographie des nanoparticules dans les organes sont fabriqués par fluorescence ou microscopie confocale. Malheureusement, ces méthodes nécessitent l'étiquetage des nanoparticules par un colorant infrarouge proche qui peut modifier la biodistribution des nanoparticules, en particulier pour de très petites nanoparticules en raison de ses propriétés hydrophobes. La détection des nanoparticules marquées, et en particulier les très petites nanoparticules (taille <10 nm), pourrait donc interférer avec leur biodistribution à toute l'échelle du corps, mais aussi au niveau de tissus et cellules. Le développement de nouveaux dispositifs capables de détecter des nanoparticules sans étiquetage offre de nouvelles possibilités pour l'étude de leur comportement et de la cinétique. En outre, le rôle des oligo-éléments tels que le fer et le cuivre dans un cerveau maladiesd maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer 1, Menkes 2,3, ou 4 Wilson suggèrent l'intérêt d'étudier et de localiser ces éléments dans les tissus.
Diverses techniques ont été utilisées pour fournir la cartographie élémentaire ou microanalyse des matériaux différents. Dans leur article de synthèse publié en 2006, R. Lobinski et al. Donne un aperçu des techniques standard disponibles pour la microanalyse élémentaire en milieu biologique, l'un des environnements les plus difficiles pour les sciences analytiques 5. La microsonde électronique, qui se compose de dispersion d'énergie micro-analyse aux rayons X dans un microscope électronique à transmission, peut être appliquée à de nombreuses études, si la concentration de l'élément est suffisante (> 100-1000 pg / g). Pour atteindre des seuils de détection inférieurs, les techniques suivantes ont été utilisées:
- microsonde faisceau d'ions en utilisant des particules induit par émission de rayons X μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
- synchrotron microanalyse de rayonnement μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- secondaire spectrométrie de masse d'ions SIMS (0,1 pg / g) 8
- ablation laser couplé par induction spectrométrie de masse LA-ICP-MS (à partir de 0,01 pg / g) 9,10
Les techniques mentionnées ci-dessus fournissent une résolution micrométrique comme indiqué dans le tableau 1 extraite de Lobinski et al.
Reconstruction 3D des enquêtes 2D série pourrait également être proposé pour la reconstruction des tissus plus profonds 11. Cependant, tous les appareils et systèmes exigent des professionnels qualifiés, modérés à l'équipement très coûteux et des expériences durables (généralement plus de 4 h pour un 100 um x 100 um pour μ-SXRF et 10 mm x 10 mm pour LA-ICP-MS ) 12. Au total, ces exigences font microanalyse élémentaire très contraignant et incompatible avec les systèmes d'imagerie optique classiques,la microscopie à fluorescence ou microscopie non linéaire. Un autre point que nous ne pouvons mentionner ici est que la capacité de mesure quantitative est encore assez limitée et dépend de la disponibilité des normes de laboratoire adaptation matricielle. La poursuite de la généralisation de l'utilisation de la microanalyse élémentaire dans les processus de l'industrie, de la géologie, de la biologie et autres domaines d'applications va générer des percées conceptuelles et technologiques importants.
Le but de la présente manuscrit est de proposer des solutions pour la cartographie élémentaire quantitative (ou microanalyse élémentaire) dans les tissus biologiques avec une instrumentation de table entièrement compatible avec la microscopie optique classique. Notre approche est basée sur la spectroscopie par claquage laser (technologie LIBS). Dans LIBS, une impulsion de laser est focalisé sur l'échantillon d'intérêt pour créer la ventilation et l'étincelle de la matière. Le rayonnement émis atomique dans le plasma est ensuite analysé par un spectromètre et l'élémentaireconcentrations mentales peuvent être récupérées avec des mesures d'étalonnage effectuées au préalable 13,14. Les avantages de la LIBS comprennent sensibilité (pg / g pour presque tous les éléments), la compacité, la préparation des échantillons très basique, l'absence de contact avec l'échantillon, une réponse instantanée et précisément localisée (micro) analyse de surface. Toutefois, l'application de l'imagerie chimique des tissus reste difficile car l'ablation laser de tissu doit être finement contrôlée pour effectuer des cartes à haute résolution spatiale avec sensibilité dans la gamme pg / g 15,16.
Avec une telle solution, l'adjonction de traceurs ou d'agents d'étiquetage n'est pas nécessaire, ce qui permet de détecter des éléments inorganiques directement dans leur environnement naturel dans les tissus biologiques. L'instrument LIBS développée dans notre laboratoire offre une résolution de courant inférieure à 100 um avec une sensibilité estimée pour Gd-dessous de 35 pg / g, ce qui équivaut à 0,1 mM 16, qui permetla cartographie des grands échantillons (> 1 cm 2) dans les 30 min. En outre, le logiciel maison facilite l'acquisition et l'exploitation des données. Cet instrument est utilisé pour détecter, carte, et de quantifier la distribution tissulaire de gadolinium nanoparticules à base de (Gd) de 17 à 18 dans les reins et les échantillons de tumeur de petits animaux, de 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules (taille <5 nm) . Les éléments inorganiques, qui sont incorporées à un tissu biologique, tels que Fe, Ca, Na et P, ont également été détectées et imagée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Appliqué à l'échantillon biologique, cette technique permet l'imagerie chimique, à savoir la cartographie et la quantification, de D.ieu et Si à partir de nanoparticules à base de Gd injectés dans différents organes. Des principaux paramètres critiques, le contrôle des propriétés laser (de longueur d'onde, l'énergie d'impulsion, de focalisation, et de stabilité) est essentiel pour une ablation de tissus fins et précis (c.-à-résolution de la cartographie) ainsi que p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier par le Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. 화학. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
