Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie
Summary
De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.
Abstract
De cerebrale cortex kenmerkt door meerdere lagen en vele verschillende celtypen die samen een netwerk zijn verantwoordelijk voor veel hogere cognitieve functies zoals besluitvorming, sensorisch-geleide gedrag of geheugen. Om te begrijpen hoe dergelijke complexe neuronale netwerken verrichten van dergelijke taken, een cruciale stap is om de functie (of elektrische activiteit) van individuele celtypen binnen het netwerk te bepalen, bij voorkeur wanneer het dier voert een relevante cognitieve taak. Bovendien is het even belangrijk om de anatomische structuur van het netwerk en de morfologische structuur van de individuele neuronen om reverse engineering de corticale netwerk bepalen. Technische doorbraken die vandaag beschikbaar zijn maken het mogelijk opnemen van cellulaire activiteit in wakker, gedragen dieren met de waardevolle optie van post hoc identificeren van de opgenomen neuronen. Hier tonen we de juxtasomal biocytine labeling techniek, die opname actie potentiometer impliceertal pieken in de extracellulaire (of losse-patch) configuratie met conventionele patch pipetten. De juxtasomal opnameconfiguratie relatief stabiel en toepasselijk over gedragsvoorwaarden, zoals verdoofd verdoofd, wakker-kop vast, en zelfs in de vrij bewegende dieren. Aldus is deze methode kan legen celtypespecifieke actiepotentiaal spiking in dierlijke gedrag reconstructie van de individuele neuronen en uiteindelijk de gehele corticale microschakeling. In deze video manuscript, laten we zien hoe individuele neuronen in de juxtasomal configuratie met biocytine in de-urethaan verdoofde rat voor post-hoc-identificatie en morfologische reconstructie kan worden bestempeld.
Introduction
Neuronale netwerken bestaan uit meerdere celtypes, gekenmerkt door zeer specifieke morfologische en fysiologische eigenschappen 1-7. Bijgevolg individuele celtypen voeren specifieke taken binnen het netwerk (zie bijvoorbeeld GENTET et al.. 8 en Burgalossi et al.. 9). We nu pas beginnen te celtype-specifieke functies te begrijpen over neuronale netwerken en veel is nog te ontdekken. Hiervoor zijn veel laboratoria uitvoering experimentele benaderingen die de analyse van de morfologische eigenschappen van hetzelfde neuronale populatie waaruit fysiologische parameters verkregen 1,10-15 mogelijk. Hier tonen we juxtasomal etiketteringstechniek 16,17 die elektrofysiologische opnames gaat met conventionele patch pipetten in de extracellulaire (dus invasief) configuratie in combinatie met elektroporatie van de opgenomen neuron met biocytine. Degrote voordeel van deze benadering is dat de invasieve aard zodat actiepotentiaal stekelige individuele neuronen wordt opgenomen zonder dat (bijvoorbeeld dialyse) de intracellulaire inhoud van de cel. Gevolgd door elektroporatie, de juxtasomal aanpak biedt de mogelijkheid van post hoc identificatie en reconstructie cel functie (fysiologie) te koppelen aan de structuur (morfologie). Typisch morfologische reconstructie omvat reconstructie van dendritische en axonale morfologie die kan worden uitgebreid voor kwantificering van de wervelkolom en / of bouton dichtheden of reconstructie van neuronale morfologie bij nanometerresolutie middels elektronenmicroscopie. De juxtasomal opnametechniek kan worden gebruikt voor in vivo opname van diverse celtypen in corticale lagen of sub-corticale gebieden in een aantal soorten, hoewel de meeste studies de techniek hebben toegepast in kleine knaagdieren zoals muizen of ratten. Ons onderzoek is gericht op het opnemen en labelen van neuronenvan de rat primaire somatosensorische cortex (S1) en het gaat om visuele identificatie van opgenomen neuronen 18, dendritische reconstructies in combinatie met nauwkeurige registratie in een gestandaardiseerde referentiekader te reverse engineeren corticale netwerken 4,19 en gedetailleerde reconstructie van axonalestructuur tot celtype-specifieke lokale kenmerken en lange afstand projectie richt 20.
Vergeleken met andere in vivo opnametechniek (intracellulair of hele-cel), juxtasomal opnamen zijn relatief stabiel en kunnen daarom worden toegepast op gedragstoestanden inclusief narcose 21,22, verdoofd 14, wakker-kop vast 23 of zelfs vrij bewegende dieren 9 . Hier tonen we juxtasomal etikettering S1 van een urethaan verdoofde rat, hoewel we benadrukken de algemene toepasbaarheid van deze techniek om veel voorbereidingen van keuze.
Protocol
Representative Results
Discussion
De juxtasomal methode laat opnemen in vivo actiepotentiaal vastspijkeren van enkele eenheden over gedragsvoorwaarden (verdoofd, wakker-hoofd vast of vrij bewegende) met de optie van-biocytine labelen van de opgenomen neuron voor post hoc celtype classificatie en / of 3D-reconstructie. Het grote voordeel is fysiologische parameters in de extracellulaire (dus invasief) informatie te verkrijgen, maar het kunnen de neuron intracellulair label met biocytine 16,17,32. Naast labeling biocytine Deze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Profs bedanken. Huibert Mansvelder en Bert Sakmann voor uitgebreide ondersteuning, dr. Marcel Oberlaender voor vruchtbare discussies en het verstrekken van neuronale tracing, en Brendan Lodder voor technische ondersteuning. De gegevens werden verkregen met behulp van de ntrode VI voor LabView, genereus geleverd door R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Dit onderzoek werd gesteund door het Max Planck Instituut en het Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (gefinancierd door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Center for Neurogenomics and Cognitive Research (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), financiering van CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 en ENC-Network # p3-c3) en de Vrije Universiteit Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
