C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界の人口の3％に影響を及ぼし、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患を引き起こす。 HCVは、 フラビウイルス科に属するエンベロープRNAウイルスである。現在の治療は、十分に有効ではなく、有害な副作用を引き起こす。利用可能なHCVワクチンはありません。このように、継続的な努力は、ワクチン、より良い治療法を開発するために必要です。 HCV細胞培養系は、ウイルスの侵入、ゲノム複製、パッケージング、および出口を含むHCV増殖の様々な段階を研究するために重要である。提示現在の手順では、野生型intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびウイルス複製を研究するために、 ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持する組換えFNX-Rlucをウイルスを使用した。ヒト肝癌細胞株（ホ-7ベースの） インビトロでのトランスフェクションのために使用したのHCVゲノムRNAを転写した。無細胞培養上清を、タンパク質溶解物およびtotal RNAは、HCVの増殖を評価するために、トランスフェクション後様々な時点で採取した。 HCVゲノムの複製の状態は、定量的RT-PCRおよびHCVの存在を可視化する二本鎖RNAにより評価した。 HCVタンパク質の発現は、HCV NS3およびNS5Aタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによって確認した。培養上清およびウイルス力価に感染性HCV粒子を放出するRNAトランスフェクトされた細胞を測定した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはHCVの複製レベルと感染性を評価するために利用した。結論として、我々は、HCVの複製サイクルの異なる段階を特徴付けるための種々のウイルス学的アッセイ法を提示する。
Introduction
C型肝炎ウイルス（HCV）は、肝硬変および肝臓癌を引き起こす。それは35万人が毎年1-3死んで全世界1.7億人々に影響を与えます。 HCVは、9.6kbのゲノムサイズを有するプラス鎖RNAウイルスである。 HCVゲノムは、タンパク質分解的に10ポリペプチドに様々な細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断され〜3,000アミノ酸残基の単一ポリタンパク質として翻訳される。 HCVはヘパシウイルス属に原型ウイルスで、 フラビウイルス科 4に属しています。暴露されると、HCVは、個人の80％に慢性感染を確立します。感染は、診断が肝劣化を防止する治療的介入を可能にすることができる主に無症候性かつタイムリーである。現在の治療は、部分最適で、ワクチンは5,6ありません。
C型肝炎の病因は1989年7に記載した。HCVの複製を研究するC型肝炎ワクチンおよび治療 の研究のために重要であるが、それがあった長い効率的なウイルス培養系の欠如によって妨げ。 HCVの分子クローンは、肝内接種8時チンパンジーにおける感染であることが示された。続いて、HCVサブゲノムレプリコンは、細胞培養系9,10におけるウイルスゲノムの複製段階を分析させ、これについて説明した。遺伝子型2aのHCVの発見は、JFH-1（日本劇症肝炎-1）を単離、細胞培養に感染することができる、HCV複製の研究11月13日のための新たな道を開いた。感染培養系をベース遺伝子型2a株JFH-1ベース間および内遺伝子型キメラウイルス遺伝子型1のHCVにも14〜18用意されています。
我々が正常タンパク質ドメインおよびシス作用RNAエレメント19,20の高分解能機能プロファイリングマップを得るために、JFH-1株およびHCV intragenotype 2aのキメラウイルスを使用している。これによれば、ここでは慣用的に使用可能にする効果的な培養システムを記載HCVの複製サイクルと宿主 – 病原体相互作用の様々な段階を研究。私たちは、ウイルスゲノムの複製とintragenotype 2aはHCVおよびウミシイタケルシフェラーゼに基づくレポーターHCVの新規の感染性を評価するために、ウイルス学的ア ッセイを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この図は、C型肝炎ウイルス複製サイクルを分析するための方法を記載している。 HCVはヒトの病原体であり、所定の生物学的安全性プロトコルは、必ず守っていただきます。感染性HCV細胞培養系は、以前に11-13,16,17記載されている。示されたプロトコルを以下のときに我々が実装し、いくつかの重要なポイントがあります。まず、下流の研究のために無傷の完全長ウイルスゲノムRNAの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
