Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

Summary

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

Vírus da Hepatite C (HCV) afeta 3% da população mundial e causa graves doenças do fígado, incluindo hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. O HCV é um vírus de ARN encapsulado pertencente à família Flaviviridae. O tratamento atual não é totalmente eficaz e causa efeitos colaterais adversos. Não há vacina HCV disponível. Assim, é necessário um esforço continuado para o desenvolvimento de uma vacina e terapia melhor. Um sistema de cultura de células de VHC é fundamental para o estudo de vários estágios de crescimento de HCV, incluindo a entrada do vírus, a replicação do genoma, as embalagens, e de saída. No processo agora apresentado, foi utilizado um vírus de tipo selvagem intragenotype 2a quimérico, FNX-HCV, e um vírus FNX-Rluc recombinante portador de um gene repórter de luciferase de Renilla para estudar a replicação do vírus. Uma linha de células de hepatoma humano (Huh-7 com base) foi utilizado para a transfecção in vitro do transcrito ARN genómico de HCV. Os sobrenadantes de cultura isentos de células, lisados ​​de proteína e tRNA otal foram colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção para avaliar o crescimento HCV. Estado de replicação do genoma do HCV foi avaliada por RT-PCR quantitativo e visualizar a presença de ARN de HCV de cadeia dupla. A expressão da proteína do VHC foi verificada por imunofluorescência blot e ensaios de Western utilizando anticorpos específicos para as proteínas do HCV NS3 e NS5A. RNA de HCV de células transfectadas divulgados partículas infecciosas em cultura sobrenadante e o título virai foi medido. Os ensaios de luciferase, foram utilizados para avaliar o nível de replicação e infecciosidade de HCV repórter. Em conclusão, nós apresentamos vários ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do HCV.

Introduction

Vírus da hepatite C (HCV) causa cirrose e câncer de fígado. Ela afeta 170 milhões de pessoas em todo o mundo, com 350.000 pessoas morrem anualmente ^1-3. O HCV é um vírus de cadeia positiva de ARN com um tamanho de genoma de 9,6 kb. O genoma do HCV é traduzido como uma única poliproteína de ~ 3000 resíduos de aminoácidos que é clivada proteoliticamente por diversas proteases celulares e virais em 10 polipéptidos. O HCV é o vírus protótipo do género Hepacivirus e pertence à família Flaviviridae ^4. Após a exposição, o HCV estabelece a infecção crónica em 80% dos indivíduos. A infecção é geralmente assintomática e oportuna diagnóstico pode permitir a intervenção terapêutica para evitar a deterioração do fígado. O tratamento atual é de qualidade inferior e nenhuma vacina está disponível ^5,6.

A etiologia da hepatite C foi descrita pela primeira vez em 1989 ^7. Estudar a replicação do HCV é importante para a vacina contra a hepatite C e pesquisa de tratamento, mas que tinha sidolongo dificultada pela falta de um sistema de cultura de vírus eficiente. Um clone molecular de HCV foi demonstrado ser infeccioso em chimpanzés mediante inoculação ^intra-8. Subsequentemente, os replicões de HCV sub-genómicos foram descritas, o que permitiu a dissecar a fase de replicação do genoma viral em um sistema de cultura de células de ^9,10. Descoberta de um VHC genótipo 2a isolar JFH-1 (Japanese fulminante da hepatite-1), capaz de infectar cultura de células abriu novos caminhos para a pesquisa a replicação do HCV ^11-13. Genótipo 2a tensão JFH-1 baseada vírus quiméricos inter-e intra-genotípicas e do genótipo 1 do HCV sistemas de cultura infecciosas base também estão disponíveis ^14-18.

Temos utilizado com sucesso JFH-1 tensão e HCV intragenotype 2a vírus quimérico para obter o mapa de alta resolução de perfil funcional de domínios de proteínas e cis-atuantes elementos de RNA ^19,20. De acordo com isto, aqui descrevemos um sistema de cultura eficaz utilizado rotineiramente que permiteestudando várias fases do ciclo de replicação do HCV e interação patógeno-hospedeiro. Apresentamos ensaios virológicos para avaliar replicação do genoma viral e infectividade de novo de intragenotype 2a HCV e HCV repórter baseado Renilla luciferase.

Protocol

Um esboço geral do protocolo é ilustrada na Figura 1. 1. Células Preparar o meio de crescimento completo, que contém 10-15% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de aminoácidos não essenciais, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), e 2 mM de L-glutamina. Manter Huh-7.5.1 células 13 em meios de cultura completos contendo os suplementos acima para análise in vitro do ciclo de replicação viral…

Representative Results

O vírus da hepatite C é um vírus de RNA. Assim, para fins de manipulação genética, o ADNc genómico do HCV foi clonado num vector de plasmídeo bacteriano. Uma sequência de promotor de polimerase de ARN T7 foi introduzida imediatamente antes da extremidade 5 'do genoma do VHC. Um esquema geral de fluxo de trabalho de análise do HCV é apresentada na Figura 1. Para gerar o ARN genómico de HCV com precisão a extremidade 3 ', o genoma do VHC que contém o plasmídeo é cortado com a enzim…

Discussion

Esta ilustração descreve um método para a análise do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. HCV é um patógeno humano eo protocolo de biossegurança prescrito terá que ser rigorosamente seguidas. Sistemas de cultura de células de HCV infecciosas foram descritos anteriormente ^11-13,16,17. Existem alguns pontos cruciais que implementamos quando seguindo o protocolo ilustrado. Primeiro, é de grande importância para uma boa qualidade de comprimento RNA genômico viral completo intacto para os est…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega