En protokol til at analysere Hepatitis C virus Replication
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Hepatitis C virus (HCV) påvirker 3% af verdens befolkning og forårsager alvorlige leversygdomme, herunder kronisk hepatitis, cirrhose og hepatocellulært carcinom. HCV er en kappebærende RNA-virus, der tilhører familien Flaviviridae. Nuværende behandling ikke er fuldt effektiv og forårsager bivirkninger. Der er ingen HCV-vaccine til rådighed. Således vedvarende indsats er påkrævet for at udvikle en vaccine og bedre behandling. En HCV cellekultur-system er afgørende for at studere forskellige stadier af HCV vækst, herunder viral indgang, genomreplikation, emballering og påstigning. I den nuværende fremgangsmåde fremlagt, vi anvendte en vildtype intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV og en rekombinant FNX-Rluc virus bærer et Renilla-luciferase-reportergen for at undersøge virusreplikation. En human hepatomacellelinie (Huh-7-baseret) blev anvendt til transfektion af in vitro-transkriberet HCV genomiske RNA'er. Cellefrie kultursupernatanter, proteinlysater og total RNA blev høstet på forskellige tidspunkter efter transfektion til at vurdere HCV-vækst. HCV-genomet replikation status blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR og visualisere tilstedeværelsen af HCV dobbeltstrenget RNA. HCV protein udtryk blev bekræftet ved Western blot og immunofluorescensassays anvender antistoffer specifikke for HCV NS3 og NS5A proteiner. HCV-RNA-transficerede celler frigivet infektiøse partikler i dyrkningssupernatanten, og den virale titer blev målt. Luciferaseassays blev benyttet til at vurdere replikation niveau og infektivitet af reporter HCV. Afslutningsvis præsenterer vi forskellige virologiske analyser til karakterisering af forskellige stadier af HCV-replikation cyklus.
Introduction
Hepatitis C virus (HCV) forårsager skrumpelever og leverkræft. Det påvirker 170 millioner mennesker på verdensplan med 350.000 mennesker dør hvert år 1-3. HCV er et positiv-strenget RNA-virus med et genom størrelse på 9,6 kb. HCV-genomet er oversat som en enkelt polyprotein på ~ 3.000 aminosyrerester, proteolytisk spaltes af forskellige cellulære og virale proteaser i 10 polypeptider. HCV er prototypen virus i slægten Hepacivirus og tilhører familien Flaviviridae 4. Ved eksponering HCV etablerer kronisk infektion i 80% af individerne. Infektionen er oftest asymptomatisk og rettidig diagnose kan tillade terapeutisk intervention for at forhindre leveren forringelse. Nuværende behandling er suboptimal og ingen vaccine er tilgængelig 5,6.
Ætiologien af hepatitis C blev først beskrevet i 1989 7.. Studere HCV-replikation er vigtigt for hepatitis C-vaccine og behandling forskning, men det havde væretlænge hæmmet af manglen på en effektiv viral kultur system. En molekylær klon af HCV blev vist at være smitsomme i chimpanser upon intrahepatisk podning 8. Efterfølgende blev HCV Subgenomiske replikoner beskrevet som tillod at dissekere det virale genom replikation fase i et cellekultursystem 9,10. Opdagelsen af en genotype 2a HCV isolere JFH-1 (japansk Fulminant hepatitis-1), er i stand til at inficere cellekultur åbnet nye muligheder for HCV-replikation forskning 11-13. Genotype 2a stamme JFH-1 baseret inter-og intra-genotypiske kimære virus og genotype 1 HCV baserede smitsomme kultur systemer er tilgængelige samt 14-18.
Vi har med succes brugt JFH-1 stamme og HCV intragenotype 2a kimære virus at opnå høj opløsning funktionelle profilering kort af protein domæner og cis-virkende RNA elementer 19,20. Ifølge dette, her beskriver vi en effektiv dyrkningssystem rutinemæssigt anvendes, der tilladerstudere forskellige stadier af HCV replikationscyklussen og vært-patogen interaktion. Vi præsenterer virologiske assays for at vurdere viral genom replikation og de novo-infektivitet intragenotype 2a HCV og en Renilla luciferase baseret reporter HCV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne illustration beskriver en fremgangsmåde til analyse af hepatitis C virus replikationscyklus. HCV er et humant patogen og den foreskrevne protokol om biosikkerhed skal følges nøje. Smitsomme HCV cellekultur systemer er blevet beskrevet tidligere 11-13,16,17. Der er nogle afgørende punkter, vi gennemfører, når du følger den illustrerede protokol. Først, er det af stor betydning at have en god kvalitet af intakt fuld længde viralt genomisk RNA for downstream studier. Input plasmid, der bærer den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
