باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار
Summary
نحن هنا شرح استخدام الفلورسنت اليكسا صبغ جانب لα-بنغاروتوكسين لقياس GABA A مستقبلات سطح توطين والإلتقام في الخلايا العصبية قرن آمون. من خلال استخدام التركيبات التي تحمل علامة خارج الخلية القصير الذي يربط α-بنغاروتوكسين، لا يمكن أن يتحقق تحليل البلازما غشاء البروتين الاتجار التقامي.
Abstract
فمن الواضح بشكل متزايد أن مستقبلات الناقل العصبي، بما في ذلك ionotropic GABA A مستقبلات (GABAAR)، المعرض الاتجار ديناميكية للغاية والتنقل سطح الخلية 1-7. لدراسة مستقبلات الخلايا السطحية وتوطين الإلتقام، والتقنية الموصوفة هنا يجمع بين استخدام الفلورسنت α-بنغاروتوكسين مع الخلايا معربا عن بنيات تحتوي على بنغاروتوكسين-α (بغت) موقع ملزم (BBS). يستند BBS (WRYYESSLEPYPD) على الوحيدات α عضلة مستقبلات النيكوتين أستيل كولين، الذي يربط بغت مع تقارب عالية 8،9. إدراج موقع BBS يسمح توطين السطحية وقياسات الإدراج مستقبلات أو إزالة مع تطبيق الفلورسنت الخارجية بغت، كما هو موضح سابقا في تتبع GABAA وmetabotropic GABAB مستقبلات 2،10. بالإضافة إلى موقع BBS، ونحن إدراج حساسة للدرجة الحموضة GFP (pHGFP 11) بين الأحماض الأمينية 4 و 5 من الوحيدات GABAAR ناضجة من قبل معيار ماستراتيجيات البيولوجيا والاستنساخ olecular PCR (انظر الشكل 1) 12. وBBS هو 3 'لمراسل GFP حساسة للدرجة الحموضة، مفصولة 13-ألانين حمض أميني / البرولين رابط. لتهريبهم الدراسات وصفها في هذا المنشور التي تستند على عينات ثابتة، يخدم pHGFP كمراسلة من إجمالي الموسومة GABAAR مستويات البروتين الوحيدات، مما يتيح تطبيع بغت المسمى مستقبلات السكان لمجموع السكان مستقبلات. هذا يقلل من خلية إلى أخرى بغت تلطيخ تقلب إشارة الناتجة عن التعبير الأساس أعلى أو أقل من مفارز GABAAR الموسومة. وعلاوة على ذلك العلامة pHGFP يتيح سهولة تحديد الخلايا بناء إعراب عن تجارب التصوير الحي أو ثابتة.
Introduction
كان رائدا في استخدام جانب fluorescently α-بنغاروتوكسين لدراسة توطين مستقبلات وديناميكية في الدراسات من مستقبلات النيكوتين أستيل 13-15، الهدف الذاتية السم ل. في وقت لاحق، وقد استخدم إدماج الحد الأدنى من الببتيد ملزمة بغت (BBS) لدراسة الاتجار في كل من القنوات الأيونية يجند بوابات مثير والمثبطة والبروتين G مستقبلات جانب 2،10،16-21. يوفر هذا الأسلوب يستند BBS-المزايا لمناهج أخرى تستخدم للدراسات الاتجار مثل أساليب biotinylation السطح، ووضع العلامات الأجسام المضادة الخلايا الحية مع الأجسام المضادة لالحواتم خارج الخلية، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP). خلال سطح الخلية يتم تعديل تساهميا biotinylation الأمينات الحرة، مع القدرة على التأثير في النشاط الخلوي. وكثيرا ما تعرقلت الدراسات القائمة على الضد من قبل المجموعات المستضد السطحي أو السد، والتي يمكن أن تغير الأحداث الاتجار. ويرجع ذلك إلى الخطوة تبيض لFRAP قtudies، مصدر قلق كبير وإتلاف بنية الخلية الأساسية. ميزة إضافية هي أن BBS الموسومة يمكن أيضا أن تستخدم ليبني منهجيات البيوكيميائية مع الاتجار بنغاروتوكسين لتقويم يقترن مستقبلات البيوتين. هذه التقنية قابلة للتطبيق بسهولة لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. للاستخدام في الخلايا التي تعبر عن أستيل النيكوتينيك (nAChR) المستقبلات، يجب استخدام مضاد توبوكورارين nAChR في جميع أنحاء البروتوكول كما هو مبين. سوف يؤدون وضع العلامات بغت سطح البسيطة (أي ما يعادل نقطة T = 0 وقت لبروتوكول الإلتقام) على خلايا untransfected في غياب توبوكورارين تقديم أدلة على nAChR الذاتية.
أحد الاعتبارات الهامة لاستخدام هذا الأسلوب هو الإدراج المناسبة من BBS بحيث كان موجودا في مكان خارج الخلية عندما يتم تسليم البروتين من الفائدة لغشاء البلازما. على سبيل المثال، المجالات N-محطة مفارز GABAAR يقيمون في التجويف الحويصلي خلال الجتارficking وتصبح خارج الخلية بعد الإدراج مستقبلات في غشاء البلازما، مما يتيح وضع العلامات المحددة لمستقبلات سطح الخلية وتقييم إزالتها من سطح الخلية الأحداث التقامي. لقد أظهرنا سابقا أن إضافة GFP، MYC، أو BBS الحواتم إلى هذا المجال من مفارز GABAAR صامت وظيفيا. يجب أن يتم تنفيذ الضوابط القياسية لضمان أن يتم التعبير عن بروتين الموسومة عند مستويات مماثلة لبناء معلم، وأنه المترجمة بشكل مناسب، وأنه لا يؤثر على وظيفة مستقبلات. وهذا توصيف البنى transfected مساعدة أيضا في المخاوف من overexpression استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقنيات الثابتة والحية BBS مقرها الموصوفة هنا يمكن استخدامها لتعقب مستقبلات غشاء البلازما أو غيرها الاتجار البروتين في خطوط الخلايا، الخلايا العصبية، والخلايا الأولية الأخرى. وقد استخدمت بنجاح هذه الطريقة لدراسة الإدراج غشاء وإزالة القنوات الأيونية يجند بوابات و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تقديم الدعم من خلال صناديق بدء التشغيل من قسم البيولوجيا الكيميائية والصيدلة في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. شكر وتقدير من أعضاء المختبر يعقوب الذين ساهموا في تقديم الفيديو: نيكولاس غراف.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
