Ved hjælp af en α-Bungarotoxin-bindingssted Tag til Study GABAA receptor membranlokalisering og handel
Summary
Her har vi demonstrere brugen af fluorescerende Alexa farvestof koblet til α-bungarotoxin at måle GABAA receptor overflade lokalisering og endocytose i hippocampus neuroner. Gennem brug af konstruktionerne, der bærer en kort ekstracellulære tag, der binder α-bungarotoxin, kan opnås analyse af plasmamembranprotein endocytiske handel.
Abstract
Det er i stigende grad klart, at neurotransmitterreceptorer, herunder ionotropic GABA A receptorer (GABAAR), udviser meget dynamisk handel og celleoverfladen mobilitet 1-7. For at undersøge receptor celleoverfladen lokalisering og endocytose, den her beskrevne teknik kombinerer brugen af fluorescerende α-bungarotoxin med celler, der udtrykker konstruktioner indeholdende en α-bungarotoxin (Bgt) bindingssted (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) er baseret på α-underenheden af musklen nikotinacetylcholinreceptoren, som binder Bgt med høj affinitet 8,9. Inkorporering af BBS hjemmeside giver overflade lokalisering og måling af receptor indsættelse eller fjernelse med anvendelse af eksogene fluorescerende Bgt, som tidligere beskrevet i sporing af GABAA og metabotropisk GABAB receptorer 2,10. Ud over BBS site, vi indsat en pH-følsom GFP (pHGFP 11) mellem aminosyrerne 4 og 5 af det modne GABAAR underenheden af standard-molecular biologi og PCR kloningsstrategier (se figur 1) 12. BBS er 3 'af pH-følsomme GFP reporter, adskilt af en 13-aminosyren alanin / prolin-linker. For trafficking undersøgelser er beskrevet i denne publikation, der er baseret på faste prøver det pHGFP fungerer som en reporter af alt mærkede GABAAR subunit protein niveauer, så normalisering af Bgt mærkede receptor population til den samlede receptor befolkning. Dette minimerer celle til celle Bgt farvning signal variation som følge af højere eller lavere baseline udtryk for de mærkede GABAAR underenheder. Desuden pHGFP tag gør det let at identificere konstruere udtrykker celler til levende eller faste billeddannelse eksperimenter.
Introduction
Anvendelsen af fluorescens koblet α-bungarotoxin for at studere receptor lokalisering og dynamik var banebrydende ved undersøgelser af nikotinacetylcholinreceptoren 13-15 toksinet endogene mål. Efterfølgende har inkorporering af den minimale Bgt bindende peptid (BBS) blevet anvendt til at undersøge handel med både stimulerende og hæmmende ligandstyrede ionkanaler og G proteinkoblede receptorer 2,10,16-21. Dette BBS-baserede teknik giver fordele til andre tilgange, der anvendes til undersøgelser for menneskehandel, såsom overflade biotinyleringsbetingelserne metoder, antistof-mærkning af levende celler med antistoffer mod ekstracellulære epitoper, og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP). Under celleoverfladen biotinyleringsbetingelserne frie aminer er kovalent modificeret med potentiale til at påvirke cellulær aktivitet. Antistof baserede undersøgelser er ofte blevet hæmmet af overfladeantigen clustering eller capping, som kan ændre begivenheder smuglerruter. På grund af blegning skridt for FRAP studies er et vigtigt indsatsområde at beskadige den underliggende cellestruktur. En yderligere fordel er, at BBS mærkede konstruktioner kan også anvendes til biokemiske metoder med biotin-koblede bungarotoxin at vurdere receptor handel. Denne teknik er let anvendelse på cellelinier og primære celler. Til brug i celler, der udtrykker nicotin-acetylcholin (nAChR)-receptorer, skal nAChR antagonist tubocurarin bruges i hele protokollen som angivet. Udførelse af en simpel overflade Bgt etikettering (svarende til T = 0 tidspunkt for endocytose protokol) på utransficerede celler i fravær af tubocurarin vil fremlægge dokumentation for endogent nAChR.
En vigtig overvejelse ved anvendelse af denne teknik er passende indsættelse af BBS, så det er til stede i en ekstracellulær placering, når proteinet af interesse er leveret til plasmamembranen. For eksempel N-terminale domæner af GABAAR underenheder bosat i vesikulære lumen under trafikskehandel og bliver ekstracellulære efter receptor indsættelse i plasmamembranen, så specifik mærkning af celleoverfladereceptorer og vurdering af deres fjernelse fra celleoverfladen ved endocytiske begivenheder. Vi har tidligere vist, at tilsætningen af GFP, myc eller BBS epitoper til dette domæne af GABAAR underenheder er funktionelt tavse. Standard kontroller bør udføres for at sikre, at den mærkede protein er udtrykt på samme niveau til et ukodet konstruktion, at det korrekt lokaliseret, og at det ikke påvirker receptor funktion. Denne karakteristik af transfekterede konstruktioner vil også støtte i fejlfinding overekspression bekymringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
BBS baserede faste og levende teknikker beskrevet her kan anvendes til at spore receptor eller anden plasmamembranprotein handel med cellelinier, neuroner og andre primære celler. Denne fremgangsmåde er med succes blevet brugt til at studere membran indsættelse og fjernelse af ligand-gatede ionkanaler og GPCR og vurdere ændringer i handel på grund af tilstedeværelsen af receptoragonister og modulatorer. Vigtige aspekter omfatte passende lokalisering af tag til et ekstracellulært sted og udføre kontroller f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der blev leveret af startup-midler fra Farmakologi og Chemical Biology Department på University of Pittsburgh School of Medicine. Anerkendelse af Jacob lab medlemmer, der har bidraget til video indsendelse: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
