L'utilisation d'un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic
Summary
Ici, nous démontrons l'utilisation de colorant fluorescent Alexa couplé à α-bungarotoxine à mesurer récepteur GABA A de localisation à la surface et l'endocytose dans les neurones de l'hippocampe. Grâce à l'utilisation de constructions portant une étiquette extracellulaire qui se lie à court α-bungarotoxine, l'analyse de la membrane plasmique protéine endocytose trafic peut être atteint.
Abstract
Il est de plus en plus évident que les récepteurs de neurotransmetteurs, dont les récepteurs ionotropiques GABAA (GABAAR), exposition traite très dynamique et la mobilité de la surface de la cellule 1-7. Pour étudier la localisation des récepteurs de surface cellulaire et l'endocytose, la technique décrite ici combine l'utilisation d'α-bungarotoxine fluorescent avec des cellules exprimant des constructions contenant une α-bungarotoxine (Bgt) du site de liaison (BBS). Le BBS (WRYYESSLEPYPD) est basé sur la sous-unité α du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de muscle, qui se lie avec une grande affinité Bgt 8,9. Incorporation du site BBS permet la localisation de surface et des mesures de l'insertion ou du retrait du récepteur avec application de la fluorescence exogène Bgt, comme décrit précédemment dans le cheminement de GABAA et GABAB récepteurs métabotropiques 2,10. En plus du site de BBS, on a inséré une GFP sensible au pH (pHGFP 11) entre les acides aminés 4 et 5 de la sous-unité mature par GABAAR m-typestratégies de biologie et de clonage PCR olecular (voir la figure 1) 12. Le BBS est en 3 'de la GFP reporter sensible au pH, séparés par une alanine / acide proline lieur 13-amino. Pour le trafic études décrites dans cette publication qui sont basées sur des échantillons fixés, le pHGFP sert un journaliste du total marqué GABAAR niveaux de sous-unité protéique, permettant la normalisation de la Bgt marqué population de récepteur à récepteur population totale. Cela minimise cellule à Bgt coloration variabilité du signal résultant de supérieur ou inférieur expression de base des sous-unités GABAAR marqués. En outre, l'étiquette pHGFP permet une identification facile des cellules de construction exprimant des expériences en direct ou fixes imagerie.
Introduction
L'utilisation de la fluorescence couplé α-bungarotoxine à étudier la localisation du récepteur et la dynamique a été lancée dans des études sur le récepteur nicotinique de l'acétylcholine 13-15, cible endogène de la toxine. Par la suite, l'incorporation du peptide minimal Bgt liaison (BBS) a été utilisée pour étudier la traite des canaux ioniques excitateurs et inhibiteurs ligand-dépendants et G récepteurs couplés aux protéines 2,10,16-21. Cette technique basée sur la BBS offre des avantages à d'autres approches utilisées pour les études de trafic tels que les méthodes de biotinylation de surface, marquage de l'anticorps de cellules vivantes avec des anticorps à des épitopes extracellulaires, et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Au cours de la surface cellulaire biotinylation amines libres sont modifiés de manière covalente, avec le potentiel d'affecter l'activité cellulaire. Études basées anticorps ont souvent été entravés par le regroupement ou le plafonnement de l'antigène de surface, ce qui peut modifier les événements de la traite. En raison de l'étape de blanchiment pour FRAP ses études, une préoccupation importante est endommager la structure cellulaire sous-jacent. Un avantage supplémentaire est que l'étiquette BBS constructions peuvent aussi être utilisées pour des méthodes biochimiques avec le trafic de récepteur couplé à la biotine bungarotoxine à ânes. Cette technique est facilement applicable à des lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour une utilisation dans des cellules qui expriment l'acétylcholine nicotinique (nAChR) des récepteurs, l'antagoniste tubocurarine nAChR doit être utilisé dans le protocole comme indiqué. Exécution d'une simple surface étiquetage Bgt (équivalent au point de temps T = 0 pour le protocole d'endocytose) sur les cellules non transfectées en l'absence de tubocurarine fournira la preuve de nAChR endogène.
Une considération importante pour l'utilisation de cette technique est l'insertion appropriée du BBS de sorte qu'il est présent à un emplacement extracellulaire lorsque la protéine d'intérêt est délivré à la membrane plasmique. Par exemple, les domaines N-terminaux des sous-unités GABAAR résident dans la lumière au cours de la traite vésiculairesficking et devenir extracellulaire après l'insertion du récepteur dans la membrane plasmatique, ce qui permet le marquage spécifique de récepteurs de surface cellulaire et l'évaluation de leur retrait de la surface de la cellule par endocytose événements. Nous avons précédemment montré que l'addition de GFP, myc, ou BBS épitopes de ce domaine de sous-unités GABAAR est fonctionnellement silencieuse. Les contrôles standard doivent être effectuées afin de s'assurer que la protéine marquée est exprimée à des niveaux similaires à un produit d'assemblage non marqué, qu'il localisé de manière appropriée, et que cela n'affecte pas la fonction du récepteur. Cette caractérisation de constructions transfectées aidera également à dépannage surexpression préoccupations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques fixes et vivants basés BBS décrites ici peuvent être utilisés pour suivre récepteur ou autre membrane plasmique protéine traite des lignées de cellules, les neurones et d'autres cellules primaires. Cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier l'insertion de membrane et la suppression des canaux ioniques et des GPCR ligand-dépendants et évaluer les changements dans le trafic en raison de la présence d'agonistes des récepteurs et des modulateurs. Aspects clés comprenne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un soutien a été fourni par startup-fonds du Département de biologie et pharmacologie chimique à l'Université de Pittsburgh School of Medicine. Accusé de membres du laboratoire Jacob qui ont contribué à la présentation de la vidéo: Nicolas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
