Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren
Summary
Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.
Abstract
Es wird zunehmend deutlich, dass Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich ionotropen GABA A-Rezeptoren (GABAAR), Ausstellungshochdynamischen Handel und Zelloberfläche Mobilität 7.1. Rezeptorzelloberflächenlokalisierung und Endozytose zu untersuchen, die hier beschriebenen Verfahren kombiniert die Verwendung von Fluoreszenz-α-Bungarotoxin-Zellen, die mit Konstrukten, die eine α-Bungarotoxin (Bgt) Bindungsstelle (BBS). Die BBS (WRYYESSLEPYPD) an der α-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Muskeln, die mit hoher Affinität Bgt 8,9 bindet. Einbau des BBS-Website ermöglicht Fläche Lokalisierung und Messung von Rezeptor Einsetzen oder Entfernen mit Applikation exogener Fluoreszenz Bgt, wie zuvor in der Verfolgung von GABAA-und GABAB-Rezeptoren 2,10 metabo beschrieben. Neben der BBS-Website, die zwischen den Aminosäuren 4 und 5 des reifen GABAAR Untereinheit durch Standard m eingesetzt wir eine pH-sensitive GFP (pHGFP 11)olecular Biologie und PCR-Klonierung Strategien (siehe Abbildung 1) 12. Die BBS ist 3 'der pH-sensitive GFP-Reporters durch ein 13-Aminosäure Alanin / Prolin-Linker getrennt ist. Für Handel in dieser Veröffentlichung, die auf festen Proben basieren beschriebenen Studien, die pHGFP dient als ein Reporter der Gesamt getaggt GABAAR Untereinheit Protein-Ebene, so dass eine Normalisierung der Bgt markierten Rezeptor Bevölkerung insgesamt Rezeptor Bevölkerung. Dies minimiert Zelle zu Bgt Färbung Signalvariabilität von höheren oder niedrigeren Ausgangs Ausdruck der markierten Untereinheiten GABAAR resultierende Zell. Außerdem die pHGFP Tag ermöglicht eine einfache Identifizierung der Konstrukt exprimierenden Zellen für Live-oder Fest Imaging Experimenten.
Introduction
Die Verwendung von fluoreszenz gekoppelt α-Bungarotoxin Rezeptor Lokalisation und Dynamik zu studieren wurde in Studien der Nikotinacetylcholinrezeptor 13-15, endogenen Ziel des Toxins Pionierarbeit geleistet. Anschließend Einbau des minimalen Bgt bindende Peptid (BBS) wurde genutzt, um Menschenhandel beider erregenden und hemmenden Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 2,10,16-21 studieren. Das BBS-basierte Technik bietet Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für den Menschenhandel Studien wie Oberflächen Biotinylierung Methoden, Antikörpermarkierung von lebenden Zellen mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Epitope und Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) verwendet. Während Zelloberflächen Biotinylierung freien Amine kovalent modifiziert, mit dem Potential, die zelluläre Aktivität beeinflussen. Antikörper basierte Studien haben oft durch Oberflächenantigen Clustering oder Deckelung, die Menschenhandel Ereignisse verändern kann behindert. Aufgrund der Bleichstufe für FRAP sTUDIEN, ist ein wichtiges Anliegen Beschädigung der zugrunde liegenden zellulären Struktur. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass BBS-markierten Konstrukte können auch für biochemische Methoden mit Biotin-gekoppelten Rezeptor Bungarotoxin zu beurteilen Handel verwendet werden. Dieses Verfahren ist leicht auf Zelllinien und Primärzellen. Zur Verwendung in Zellen, die nikotinergen Acetylcholin (nAChR)-Rezeptoren exprimieren, muß die nAChR-Antagonisten Tubocurarin gesamten Protokoll verwendet werden, wie angegeben. Durchführen einer einfachen Oberfläche Bgt Kennzeichnung (entspricht der T = 0 Zeitpunkt für die Endozytose-Protokoll) auf nicht-transfizierten Zellen in Abwesenheit von Tubocurarin wird Nachweis von endogenen nAChR bereitzustellen.
Eine wichtige Überlegung für die Verwendung dieser Technik entsprechende Einsetzen der BBS, so dass es an einer extrazellulären Stelle, wenn das Protein von Interesse an die Plasmamembran geliefert vorliegt. Zum Beispiel können die N-terminalen Domänen von GABAAR Einheiten befinden sich in den Bläschen Lumen während TRAFHandels und werden nach Einsetzen Rezeptor in der Plasmamembran der extrazellulären, so dass spezifische Markierung von Zelloberflächenrezeptoren und die Bewertung ihrer Entfernung von der Zelloberfläche von endozytischen Veranstaltungen. Wir haben früher gezeigt, dass die Zugabe von GFP, myc oder BBS Epitope dieser Domäne GABAAR Einheiten funktionell still. Standardkontrollen durchgeführt werden sollte, um sicherzustellen, dass das markierte Protein wird in ähnlichen Mengen zu einer unbezeichnet Konstrukt exprimiert wird, dass es angemessen lokalisiert, und dass es keinen Einfluss auf die Rezeptorfunktion. Diese Charakterisierung von transfizierten Konstrukte werden auch bei der Fehlersuche die Überexpression Anliegen zu unterstützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen BBS Basis fest und Live-Techniken können verwendet werden, um Rezeptor oder anderen Plasmamembranprotein Handel in Zelllinien, Neuronen und anderen primären Zellen zu verfolgen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Membran Einsetzen und Entfernen der Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und GPCR untersuchen und Veränderungen in den Handel zu beurteilen aufgrund der Gegenwart der Rezeptor-Agonisten und Modulatoren. Schwerpunkte sind entsprechende Lokalisierung der Tag, um eine extrazelluläre Lage u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung wurde von startup-Mittel aus der Pharmakologie und Chemische Biologie-Abteilung an der Universität von Pittsburgh School of Medicine. Bestätigung der Jacob Labor-Mitglieder, die an der Video-Vorlage beigetragen: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
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