שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר
Summary
כאן אנו מדגימים את השימוש בצבע ניאון אלקסה מצמידים את α-bungarotoxin למדוד GABA לוקליזציה הקולטן לפני השטח ואנדוציטוזה בנוירונים בהיפוקמפוס. באמצעות השימוש במבנים הנושאים תג תאי קצר שנקשר α-bungarotoxin, ניתוח של סחר endocytic פלזמה קרום חלבון יכול להיות מושגת.
Abstract
זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי קולטני הנוירוטרנסמיטר, כולל קולטנים ionotropic GABA (GABAAR), תערוכת סחר דינמי מאוד וניידות פני תא 1-7. ללמוד לוקליזציה קולטן תא שטח ואנדוציטוזה, הטכניקה המתוארת כאן משלבת את השימוש של α-bungarotoxin ניאון עם תאים המבטאים מבנים המכילים α-bungarotoxin (bgt) אתר קישור (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) מבוסס על מקטע α של הקולטן השרירים ניקוטינית אצטילכולין, אשר נקשר bgt עם זיקה גבוהה 8,9. התאגדות של אתר BBS מאפשרת לוקליזציה פני השטח ומדידות של הכנסת קולטן או ההסרה עם יישום של ניאון אקסוגניים bgt, כפי שתוארה לעיל במעקב של GABAA וGABAB metabotropic הקולטני 2,10. בנוסף לאתר BBS, הכנסנו ה-GFP pH רגיש (pHGFP 11) בין חומצות אמינו 4 ו -5 למקטע GABAAR הבוגר על ידי מ 'סטנדרטיאסטרטגיות ביולוגיה ושיבוט PCR olecular (ראו איור 1) 12. BBS הוא 3 'של כתב ה-GFP pH רגיש, מופרד על ידי מקשר אלנין החומצה / פרולין 13-אמינו. לסחר במחקרים שתוארו בפרסום זה, המבוסס על דגימות קבועות, pHGFP משמש ככתב בסך הכל מתויג רמות חלבון למקטע GABAAR, המאפשר נורמליזציה של bgt כותרת אוכלוסיית הקולטן לסך אוכלוסיית הקולטן. זה ממזער תא לתא השתנות אות מכתים bgt כתוצאה מביטוי בסיסי גבוה יותר או נמוך יותר של יחידות משנה GABAAR המתויגות. יתר על כן תג pHGFP מאפשר זיהוי קל של תאים לבנות להביע לניסויי הדמיה חיים או קבועים.
Introduction
השימוש בfluorescently יחד α-bungarotoxin ללמוד לוקליזציה קולט ודינמיקה היה חלוץ במחקרים של הקולטן ניקוטינית אצטילכולין 13-15, יעד אנדוגני של הרעלן. בהמשך לכך, שילוב של פפטיד המינימלי bgt המחייב (BBS) נעשה שימוש כדי ללמוד סחר של שני ערוצי הגירוי ואת מעכבות מגודרת יגנד יון וקולטנים בשילוב חלבון G 2,10,16-21. טכניקה מבוססת BBS זה מספקת יתרונות לגישות אחרות המשמשות ללימודי סחר כגון שיטות biotinylation פני השטח, תיוג נוגדן של תאי חיים עם נוגדנים לאפיטופים תאיים, והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP). במהלך פני תא biotinylation אמינים חופשיים קוולנטית עדכון אחרונים, עם הפוטנציאל להשפיע על פעילות תאית. מחקרים מבוססי נוגדנים לעתים קרובות כבר הקשו על ידי אשכולות אנטיגן פני השטח או מכסת, אשר יכול לשנות אירועי סחר בנשים. בשל צעד הלבנת עבור FRAP יםtudies, נושא חשוב הוא נזק למבנה התאי הבסיסי. יתרון נוסף הוא שBBS מתויג גם מבנים יכולים לשמש למתודולוגיות ביוכימיים בסחר קולט bungarotoxin לישבני מצמידים ביוטין. טכניקה זו היא בקלות החלים על שורות תאים ותאים ראשוניים. לשימוש בתאים המבטאים אצטילכולין ניקוטינית קולטנים (nAChR), tubocurarine אנטגוניסט nAChR חייב להיות בשימוש בכל הפרוטוקול כפי שצוין. ביצוע תיוג משטח פשוט bgt (שווה ערך לנקודת זמן T = 0 לפרוטוקול אנדוציטוזה) על תאי untransfected בהעדר tubocurarine יספק ראיות לnAChR אנדוגני.
שיקול חשוב לשימוש בטכניקה זו הוא כניסה מתאימה של BBS, כך שהוא נמצא במיקום תאי כאשר החלבון של העניין מועבר קרום הפלזמה. לדוגמא, תחומים N-המסוף של יחידות משנה GABAAR מתגוררים בלומן ועי במהלך trafficking ולהיות תאיים לאחר הכניסה הקולטן בקרום הפלזמה, המאפשרים תיוג ספציפי של קולטני תא שטח והערכה להסרתם מתא השטח על ידי אירועי endocytic. הראינו בעבר כי התוספת של ה-GFP, myc, או BBS אפיטופים לתחום הזה של יחידות משנה GABAAR הוא פונקציונלי שקט. יש לבצע בקרות סטנדרטיות כדי להבטיח כי החלבון מתויג באו לידי ביטוי ברמות דומות למבנה שאינו מתויג, שזה מקומי כראוי, ושזה לא משפיע על תפקוד הקולטן. זה אפיון של מבני transfected גם יסייע בחששות ביטוי יתר לפתרון בעיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקות קבועות וחיות המבוססות BBS המתוארים כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר קולט או סחר אחר פלזמה קרום חלבון בשורות תאים, תאי עצב, תאים ראשוניים אחרים. שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד החדרת קרום וההסרה של תעלות יונים מגודרת יגנד וGPCR ולהעריך בשל נוכחותם של אגוניסטים לקולטן ומא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה סופקה על ידי הפעלה-כספים מהמחלקה לביולוגיה כימית ופרמקולוגיה בבית הספר לאוניברסיטת פיטסבורג ספר לרפואה. הכרה של חברי המעבדה יעקב שתרמו להגשת וידאו: ניקולס גרף.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
