GABA एक रिसेप्टर झिल्ली स्थानीयकरण और तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक α-bungarotoxin बाध्यकारी साइट टैग का उपयोग
Summary
यहाँ हम GABA hippocampal न्यूरॉन्स में एक रिसेप्टर सतह स्थानीयकरण और endocytosis करने के लिए उपाय bungarotoxin α के लिए युग्मित फ्लोरोसेंट एलेक्सा डाई के उपयोग के प्रदर्शन. Α-bungarotoxin, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन endocytic तस्करी का विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है कि बांध में एक छोटी बाह्य टैग असर निर्माणों के उपयोग के माध्यम से.
Abstract
यह तेजी से स्पष्ट है कि ionotropic GABA एक रिसेप्टर्स (GABAAR), प्रदर्शनी अत्यधिक गतिशील तस्करी और कोशिका की सतह गतिशीलता 1-7 सहित neurotransmitter रिसेप्टर्स. रिसेप्टर सेल सतह स्थानीयकरण और endocytosis का अध्ययन करने के लिए, यहाँ वर्णित तकनीक कोशिकाओं को एक α-bungarotoxin (BGT) बाध्यकारी साइट (बीबीएस) युक्त निर्माणों को व्यक्त करने के साथ फ्लोरोसेंट α-bungarotoxin के प्रयोग को जोड़ती है. बीबीएस (WRYYESSLEPYPD) उच्च आत्मीयता 8,9 साथ BGT बांधता है जो मांसपेशियों निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर के α सबयूनिट पर आधारित है. बीबीएस साइट का समावेश पहले गाबा और metabotropic GABAB की ट्रैकिंग 2,10 रिसेप्टर्स में वर्णित के रूप में, सतह स्थानीयकरण और रिसेप्टर प्रविष्टि या एक्सोजेनस फ्लोरोसेंट BGT के आवेदन के साथ हटाने की माप की अनुमति देता है. बीबीएस साइट के अलावा, हम अमीनो एसिड 4 और मानक एम द्वारा परिपक्व GABAAR सबयूनिट के 5 के बीच एक पीएच संवेदनशील GFP (pHGFP 11) डालाolecular जीव विज्ञान और पीसीआर क्लोनिंग रणनीतियों 12 (1 चित्र देखें). बीबीएस एक 13 अमीनो एसिड alanine / प्रोलाइन linker द्वारा अलग पीएच संवेदनशील GFP संवाददाता, 3 'है. कुल एक संवाददाता BGT को सामान्य बनाने में कुल रिसेप्टर आबादी के लिए रिसेप्टर आबादी लेबल की अनुमति, GABAAR सबयूनिट प्रोटीन के स्तर में चिह्नित के रूप में तय नमूनों के आधार पर कर रहे हैं कि इस प्रकाशन में वर्णित पढ़ाई की तस्करी के लिए, pHGFP में कार्य करता है. इस में चिह्नित GABAAR सब यूनिटों के अधिक या कम आधारभूत अभिव्यक्ति से उत्पन्न BGT धुंधला संकेत परिवर्तनशीलता सेल से सेल को कम करता है. इसके अलावा pHGFP टैग रहते हैं या तय इमेजिंग प्रयोगों के लिए निर्माण व्यक्त कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए सक्षम बनाता है.
Introduction
के fluorescently रिसेप्टर स्थानीयकरण और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए α-bungarotoxin युग्मित उपयोग निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर 13-15, विष के अंतर्जात लक्ष्य की पढ़ाई में बीड़ा उठाया था. बाद में, कम से कम BGT बाध्यकारी पेप्टाइड (बीबीएस) का समावेश दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक ligand-gated आयन चैनलों और जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स 2,10,16-21 की तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस BBS आधारित तकनीक ऐसी सतह biotinylation तरीकों, कोशिकी epitopes के लिए एंटीबॉडी के साथ जीवित कोशिकाओं के एंटीबॉडी लेबलिंग, और photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में तस्करी अध्ययन के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों के लिए लाभ प्रदान करता है. कोशिका की सतह के दौरान biotinylation मुक्त amines covalently सेलुलर गतिविधि को प्रभावित करने की क्षमता के साथ, संशोधित कर रहे हैं. एंटीबॉडी आधारित अध्ययन अक्सर तस्करी की घटनाओं को बदल सकते हैं जो सतह प्रतिजन क्लस्टरिंग या कैपिंग, द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. कारण FRAP के लिए विरंजन चरण परtudies, एक महत्वपूर्ण चिंता अंतर्निहित सेलुलर संरचना हानिकारक है. एक अतिरिक्त लाभ BBS निर्माणों भी बायोटिन मिलकर गधों bungarotoxin रिसेप्टर की तस्करी के साथ जैव रासायनिक तरीके के लिए इस्तेमाल किया जा सकता टैग किया है. इस तकनीक को सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं को आसानी से लागू है. संकेत के रूप में निकोटिनिक acetylcholine (nAChR) रिसेप्टर्स व्यक्त कि कोशिकाओं में उपयोग के लिए, nAChR प्रतिपक्षी tubocurarine प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Tubocurarine के अभाव में untransfected कोशिकाओं पर (endocytosis प्रोटोकॉल के लिए टी = 0 समय बिंदु के बराबर) एक सरल सतह BGT लेबलिंग का निष्पादन अंतर्जात nAChR के सबूत प्रदान करेगा.
यह ब्याज की प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के लिए दिया जाता है जब एक बाह्य स्थान पर मौजूद है इतना है कि इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार बीबीएस का उचित प्रविष्टि है. उदाहरण के लिए, GABAAR सब यूनिटों के एन टर्मिनल डोमेन traf दौरान vesicular लुमेन में रहते हैंficking और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स और endocytic घटनाओं से कोशिका की सतह से उनके हटाने के आकलन के विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति, प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर प्रविष्टि के बाद बाह्य हो गया है. हम पहले से GFP, Myc, या बीबीएस के अलावा GABAAR सब यूनिटों की इस डोमेन को epitopes पता चला है कि कार्यात्मक चुप है. मानक नियंत्रण यह उचित स्थानीयकृत कि, टैग प्रोटीन एक untagged का निर्माण करने के लिए समान स्तर पर व्यक्त की है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया, और यह रिसेप्टर समारोह को प्रभावित नहीं करता है कि किया जाना चाहिए. ट्रांसफ़ेक्ट निर्माणों की यह लक्षण वर्णन भी समस्या निवारण overexpression चिंताओं में सहायता करेगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित BBS आधारित निश्चित और जीने तकनीक रिसेप्टर या सेल लाइनों, न्यूरॉन्स, और अन्य प्राथमिक कोशिकाओं में अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पद्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
समर्थन चिकित्सा के पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के स्कूल में औषध विज्ञान और रासायनिक जीवविज्ञान विभाग से स्टार्टअप फंड द्वारा प्रदान किया गया. निकोलस Graff: वीडियो प्रस्तुत करने के लिए जो योगदान दिया याकूब प्रयोगशाला के सदस्यों का आभार.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
