L'utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico
Summary
Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.
Abstract
E 'sempre più evidente che recettori per i neurotrasmettitori, tra cui i recettori ionotropici GABA A (GABAAR), mostre traffico altamente dinamico e la mobilità di superficie delle cellule 1-7. Per studiare recettore cellulare localizzazione superficie e endocitosi, la tecnica qui descritta combina l'uso di fluorescente α-bungarotossina con cellule che esprimono costrutti contenenti un α-bungarotossina (Bgt) sito di legame (BBS). Le BBS (WRYYESSLEPYPD) è basato sulla subunità α del muscolo recettore nicotinico, che si lega con alta affinità Bgt 8,9. Incorporazione del sito BBS consente localizzazione superficie e misure di inserimento recettore o la rimozione con applicazione di fluorescente esogeno Bgt, come precedentemente descritto nel monitoraggio di GABAA e GABAB recettori metabotropici 2,10. Oltre al sito BBS, abbiamo inserito un GFP sensibile al pH (pHGFP 11) tra aminoacidi 4 e 5 del maturo GABAAR subunità da m normastrategie di biologia e clonazione PCR olecular (vedi figura 1) 12. Il BBS è 3 'del reporter GFP sensibile al pH, separati da un 13-amminoacido alanina / prolina linker. Per il traffico di studi descritti in questa pubblicazione che si basano su campioni fissati, il pHGFP serve come reporter del totale tagged GABAAR livelli della proteina subunità, che consente la normalizzazione della Bgt etichettato popolazione di recettori per la popolazione recettore totale. Questo minimizza cella a cella Bgt variabilità segnale colorazione risultante dalla maggiore o minore espressione basale delle subunità GABAAR contrassegnate. Inoltre, il tag pHGFP consente una facile identificazione di cellule che esprimono costrutto per esperimenti di imaging dal vivo o fissi.
Introduction
L'uso di fluorescenza accoppiato α-bungarotossina studiare localizzazione recettore e dinamiche è stato sperimentato in studi del acetilcolina recettore nicotinico 13-15, Obiettivo endogeno di una tossina. Successivamente, l'incorporazione del minimo peptide vincolante Bgt (BBS) è stato utilizzato per studiare il traffico di entrambi i canali ionici ligando-dipendenti eccitatori e inibitori e proteine G recettori accoppiati 2,10,16-21. Questa tecnica basata su BBS offre vantaggi ad altri approcci utilizzati per lo studio di traffico come i metodi biotinilazione superficie, l'etichettatura degli anticorpi di cellule vive con anticorpi verso epitopi extracellulari, e il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP). Durante superficie cellulare biotinilazione ammine libere sono covalentemente modificati, con il potenziale per influenzare l'attività cellulare. Studi basati anticorpo sono stati spesso ostacolati da antigene di superficie di clustering o tappatura, che possono alterare gli eventi di traffico. A causa del passaggio sbiancante per FRAP sTUDI, una preoccupazione importante sta danneggiando la struttura cellulare sottostante. Un ulteriore vantaggio è che BBS etichettato costrutti possono essere utilizzati anche per metodologie biochimiche con traffico biotina-recettore accoppiato bungarotoxin per valutare. Questa tecnica è facilmente applicabile a linee cellulari e cellule primarie. Per l'uso in cellule che esprimono nicotinico per l'acetilcolina (nAChR) recettori, l'antagonista tubocurarina nAChR deve essere utilizzato in tutto il protocollo, come indicato. Esecuzione di etichettatura Bgt semplice superficie (equivalente al punto di tempo T = 0 per il protocollo endocitosi) sulle cellule non trasfettate in assenza di tubocurarina fornirà la prova di endogeno nAChR.
Una considerazione importante per l'utilizzo di questa tecnica è opportuno inserimento del BBS in modo che sia presente in un extracellulari quando la proteina di interesse è trasportato alla membrana plasmatica. Ad esempio, i domini N-terminali delle subunità GABAAR risiedono nel lume vescicolari durante trafla tratta e diventare extracellulare dopo l'inserimento del recettore nella membrana plasmatica, consentendo un'etichettatura specifica di recettori di superficie delle cellule e la valutazione della loro rimozione dalla superficie cellulare da eventi endocitiche. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di GFP, myc, o BBS epitopi a questo dominio di subunità GABAAR è funzionalmente silenzioso. Controlli standard devono essere effettuate per garantire che la proteina marcata è espressa a livelli simili a un costrutto non etichettato, che opportunamente localizzato, e che non influenza la funzione del recettore. Questa caratterizzazione di costrutti trasfettate sarà anche un aiuto per la risoluzione di problemi iperespressione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche fisse e live basati BBS qui descritti possono essere utilizzati per monitorare recettore o altra membrana plasmatica traffico di proteine in linee cellulari, neuroni e altre cellule primarie. Questo metodo è stato usato con successo per studiare l'inserimento e la rimozione della membrana dei canali ionici ligando-dipendenti e GPCR e valutare variazioni di traffico per la presenza di agonisti dei recettori e modulatori. Gli aspetti chiave includono la localizzazione appropriata del tag in una posi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno è stato fornito da avvio-fondi del Dipartimento di Biologia Farmacologia e Chimica presso l'Università di Pittsburgh School of Medicine. Riconoscimento dei membri del laboratorio Giacobbe che hanno contribuito alla presentazione del video: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
