GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して
Summary
ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。
Abstract
これは、ますます明らかであるイオンチャネル型GABA A受容体（GABAAR）、展示高度に動的な輸送および細胞表面移動度1-7を含む神経伝達物質受容体、。受容体細胞表面局在化およびエンドサイトーシスを研究するために、ここに記載された技術は、α-ブンガロトキシン（BGT）結合部位（BBS）を含む構築物を発現する細胞と蛍光α-ブンガロトキシンの使用を兼ね備えています。 BBS（WRYYESSLEPYPD）は、高親和性8,9でBGTをバインドし、筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットに基づいています。掲示板サイトの取り込みは、以前に、GABA Aと代謝型GABABの追跡2,10受容体で説明したように、表面局在および受容体の挿入または外因性蛍光BGTの適用と除去の測定を可能にする。 BBS部位に加えて、我々は標準mで成熟GABAARサブユニットのアミノ酸4と5の間のpH感受性GFP（pHGFP 11）に挿入olecular分子生物学およびPCRクローニングストラテジー12（ 図1参照）。 BBSは、13個のアミノ酸のアラニン/プロリンリンカーにより分離、pH感受性GFPレポーターの3 'である。固定したサンプルに基づいており、この文書に記載されて人身売買の研究のために、pHGFPが全体の記者がBGTの正規化は、全受容体集団に受容体集団をラベル付けできるように、GABAARサブユニットタンパク質レベルタグとして機能します。これはタグ付けされたGABAARサブユニットの高いまたは低いベースライン発現に起因する細胞BGT染色シグナルの変動にセルを最小限に抑えることができます。さらにpHGFPタグは、ライブまたは固定イメージング実験用の細胞を発現する構築物を容易に識別することができます。
Introduction
の蛍光体の局在とダイナミクスを研究するため、α-ブンガロトキシンを結合された使用は、ニコチン性アセチルコリン受容体13〜15、毒素の内因性標的の研究で開拓された。続いて、最小限のBGT結合ペプチド（BBS）の組み込みは、興奮性および阻害性リガンド依存性イオンチャネルおよびGタンパク質共役受容体2,10,16-21両方の輸送を研究するために使用されている。このBBSベースの技術は、表面ビオチン化法、細胞外エピトープに対する抗体を用いた生細胞の抗体標識、および（FRAP）を光退色後蛍光回復などの人身売買の研究に使用される他のアプローチには利点を提供します。細胞表面の間にビオチン化遊離アミンが共有結合し細胞活性に影響を与える可能性を秘めた、変更されます。抗体ベースの研究は、多くの場合、人身売買のイベントを変更することができ、表面抗原クラスタリングまたはキャッピングによって妨げられてきた。原因FRAP sの漂白工程へtudies、重要な関心事は、下にある細胞構造を損傷している。さらなる利点は、BBSが構築物はまた、ビオチン結合ロバにブンガロトキシン受容体の輸送生化学手法を用いることができるタグ付けすることである。この技術は、細胞株および初代細胞に容易に適用可能である。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。ツボクラリンの非存在下でトランスフェクトしていない細胞に（エンドサイトーシスプロトコルのT = 0の時点に相当）の単純な表面BGT標識を行うと、内因性nAChRの証拠を提供する。
それは、目的のタンパク質が原形質膜に送達される細胞外の位置に存在するように、この技術を使用するための重要な考慮事項は、BBSの適切な挿入である。例えば、GABAARサブユニットのN-末端ドメインは、人身中に水疱ルーメン内に常駐fickingおよび細胞表面受容体およびエンドサイトーシスイベントによる細胞表面からの除去の評価の特異的標識を可能にする、原形質膜中の受容体の挿入後に細胞外になります。我々は以前GABAARサブユニットのこのドメインへのGFP、mycを、BBS又はエピトープの添加は、機能的にサイレントであることが示されている。標準コントロールは、それが適切に局在すること、タグ付きタンパク質はタグなし構築物に類似したレベルで発現されることを保証するために行われ、それが受容体の機能に影響を与えないべきである。トランスフェクトコンストラクトのこの特性は、トラブルシューティングの過剰発現の懸念を支援します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するBBS基づいて、固定技術は、生細胞株、ニューロン、および他の一次細胞における受容体または他の原形質膜タンパク質の輸送を追跡するために使用することができる。この方法は、正常膜挿入およびリガンド依存性イオンチャネルの除去およびGPCRを研究による受容体アゴニストおよびモジュレーターの存在下にトラフィッキングの変化を評価するために使用されている。重要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サポートは、医学のピッツバーグ大学大学院の薬理学およびケミカルバイオロジー部門からスタートアップ資金によって提供された。ニコラス·グラフ：ビデオの提出に貢献ヤコブラボメンバーの謝辞。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
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