Ved hjelp av en α-bungarotoxin Binding Side Tag til Study GABA A-reseptoren Membran Lokalisering og menneskehandel
Summary
Her kan vi demonstrere bruk av fluorescerende Alexa fargestoff koblet til α-bungarotoxin å måle GABA A-reseptoren overflaten lokalisering og endocytose i hippocampus nevroner. Gjennom bruk av konstruksjoner som bærer en kort ekstracellulære tag som binder α-bungarotoxin, kan analyse av plasma membran protein endocytic menneskehandel oppnås.
Abstract
Det er stadig tydeligere at nevrotransmitterreseptorer, inkludert ionotrofe GABA A-reseptorer (GABAAR), utviser svært dynamisk menneskehandel og celleoverflaten mobilitet 1-7. Å studere reseptor celleoverflaten lokalisering og endocytose, teknikken beskrevet her kombinerer bruk av fluorescerende α-bungarotoxin med celler uttrykker konstruksjoner som inneholder en α-bungarotoxin (Bgt) bindingssetet (BBS). Den BBS (WRYYESSLEPYPD) er basert på α-underenheten av muskelen nikotin-acetylcholin reseptoren, som bindes med høy affinitet Bgt 8,9. Inkorporering av BBS området tillater overflate lokalisering og måling av reseptor innsetting eller fjerning med anvendelse av eksogen fluorescerende Bgt, som tidligere beskrevet i sporing av GABAA-og metabotropic GABAB reseptorer 2,10. I tillegg til den BBS side, settes inn vi et pH-følsomt GFP (pHGFP 11) mellom aminosyrene 4 og 5 i det modne GABAAR subenheten av standard molecular biologi og PCR kloning strategier (se figur 1) 12. BBS er 3 'av pH-sensitive GFP reporter, atskilt med en 13-aminosyre alanine / prolin linker. For menneskehandel studier beskrevet i denne publikasjonen som er basert på faste prøver, serverer pHGFP som reporter for total tagget GABAAR subenhet protein nivåer, slik at normalisering av Bgt merket reseptor befolkningen til total reseptor befolkningen. Dette minimerer celle til celle Bgt flekker signal variasjon som følge av høyere eller lavere baseline uttrykk for de merkede GABAAR subenheter. Videre pHGFP tag muliggjør enkel identifisering av konstruere uttrykke celler for live eller faste bildebehandling eksperimenter.
Introduction
Bruken av fluorescensmerket koplet α-bungarotoxin å studere reseptor-lokalisering og dynamikk ble utviklet i studier av den nikotin-acetylcholin reseptoren 13-15, toksinet er endogene målet. Senere har innlemmelse av minimal Bgt bindende peptid (BBS) blitt brukt til å studere smugling av både stimulerende og hemmende ligandstyrte ionekanaler og G protein koblede reseptorer 2,10,16-21. Dette BBS-baserte teknikken gir fordeler til andre tilnærminger som brukes for menneskehandel studier som overflate biotinylering metoder, antistoff merking av levende celler med antistoffer mot ekstracellulære epitoper, og fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP). I løpet av celleoverflate biotinylering frie aminer er kovalent modifisert, med mulighet for å påvirke cellulær aktivitet. Antistoff baserte studier har ofte blitt hemmet av overflateantigen clustering eller tildekking, som kan endre trafficking hendelser. På grunn av den bleketrinn for FRAP studies, er en viktig bekymring skade den underliggende cellestruktur. En ekstra fordel er at BBS merket konstruksjoner kan også brukes til biokjemiske metoder med biotin-coupled bungarotoxin til asses reseptor menneskehandel. Denne teknikken kan anvendes lett til cellelinjer og primære celler. For bruk i cellene som uttrykker nikotin acetylkolin (nAChR) reseptorer, må nAChR antagonist tubocurarine brukes gjennom hele protokollen som angitt. Utføre en enkel overflate Bgt merking (ekvivalent med T = 0 tidspunktet for endocytose protokoll) på untransfected celler i fravær av tubokurarin vil gi bevis på endogen nAChR.
En viktig faktor for å bruke denne teknikken er egnet for innsetting i BBS slik at den er til stede ved et ekstracellulært sted når proteinet av interesse blir levert til plasmamembranen. For eksempel, de N-terminale domener av GABAAR subenheter bor i de vesicula lumen under traneskehandel og bli ekstracellulært etter reseptor innsetting i plasmamembranen, slik at spesifikk merking av celleoverflatereseptorer og vurdering av deres fjerning fra celleoverflaten ved endocytiske arrangementer. Vi har tidligere vist at tilsetning av GFP, myc eller BBS-epi-toper i dette domenet av GABAAR subenheter er funksjonelt stille. Standardkontroller bør utføres for å sikre at den kodede protein er uttrykt på tilsvarende nivå i et ukodet konstruksjon, at det på riktig lokalisert, og at den ikke påvirker reseptorfunksjonen. Dette karakterisering av transfekterte konstruksjoner vil også hjelpe til med feilsøking høyekspresjonsystemer bekymringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De BBS baserte faste og levende teknikker som er beskrevet her kan brukes til å spore-reseptor eller et annet plasma membran protein handel med cellelinjer, nerveceller, og andre primære celler. Denne fremgangsmåten har blitt brukt til å studere membran innsetting og fjerning av ligand-gated ionekanaler og GPCR og vurdere endringer i handel på grunn av tilstedeværelsen av reseptoragonister og modulatorer. Viktige aspekter er hensiktsmessig lokalisering av koden til et ekstracellulært sted og utfører kontroller f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtte ble gitt av oppstartsfond fra Pharmacology and Chemical Biology avdeling ved University of Pittsburgh School of Medicine. Erkjennelse av Jacob lab medlemmer som har bidratt til videoen innsending: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
