Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли
Summary
Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.
Abstract
Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности 1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством 8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов 2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP 11) между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) 12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.
Introduction
Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина 13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов 2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Во поверхности клетки биотинилирования свободные амины ковалентно модифицированный, с потенциалом, чтобы повлиять на клеточную активность. Исследования, основанные антитела часто мешает поверхностного антигена кластеризации или укупорки, которая может изменить события с торговлей людьми. В связи с этапа отбелки на FRAP сtudies, важной задачей является повреждения основной клеточную структуру. Дополнительным преимуществом является то, что BBS отмеченных конструкции также могут быть использованы для биохимических методик с оборота рецептора в сочетании биотин-Бунгаротоксин ослов. Этот метод легко применим к клеточных линий и первичных клеток. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. Выполнение простой поверхности BGT маркировки (эквивалент Т = 0 момент времени для протокола эндоцитоза) на нетрансфицированных клеток в отсутствие тубокурарина, должны представить доказательства эндогенного Nachr.
Важным фактором для использования этого метода является целесообразным введение в BBS так, что он присутствует на внеклеточный месте, когда представляющий интерес белок доставляется в плазматической мембране. Например, N-концевые домены из GABAAR субъединиц проживают в везикулярного просвета во торговлей людьмиговли и стать внеклеточного рецептора после введения в плазматической мембране, что позволяет конкретной маркировки рецепторами клеточной поверхности и оценка их удаления с поверхности клеток с помощью эндоцитотических событий. Ранее нами было показано, что добавление GFP, Myc, или BBS эпитопов в этой области GABAAR субъединиц функционально молчание. Стандартные элементы должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что меченый белок экспрессируется на том же уровне, чтобы без метки конструкции, что она соответствующим образом локализованы, и что он не влияет на функцию рецептора. Эта характеристика трансфектированных конструкций также поможет в устранении неполадок проблем избыточной экспрессии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удал?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержку оказали запуска-фондов от биологического факультета фармакологии и химической в университете Питтсбурга школа медицины. Подтверждение Иакова членов лаборатории, которые внесли свой вклад в видео представления: Николай Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
