El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico
Summary
Aquí se demuestra el uso de colorante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localización en la superficie del receptor y endocitosis en las neuronas del hipocampo. A través del uso de construcciones que tienen una etiqueta extracelular corta que se une α-bungarotoxina, análisis de membrana de tráfico endocítica de proteínas de plasma se puede lograr.
Abstract
Cada vez es más evidente que los receptores de neurotransmisores, entre ellos los receptores ionotrópicos GABAA (GABAAR), exhibición tráfico altamente dinámico y la movilidad de la superficie celular 1-7. Para estudiar receptor de células localización en la superficie y la endocitosis, la técnica descrita aquí combina el uso de fluorescente α-bungarotoxina con células que expresan construcciones que contienen un-bungarotoxina α (Bgt) sitio de unión (BBS). El BBS (WRYYESSLEPYPD) se basa en la subunidad α del receptor nicotínico de la acetilcolina del músculo, que se une con alta afinidad Bgt 8,9. Incorporación del sitio BBS permite la localización de la superficie y mediciones de la inserción del receptor o la retirada con la aplicación de fluorescente exógeno Bgt, tal como se describe anteriormente en el seguimiento de GABAA y metabotrópicos GABAB receptores 2,10. Además del sitio de BBS, insertamos una GFP sensible al pH (pHGFP 11) entre los aminoácidos 4 y 5 de la subunidad madura GABAAR por m estándarestrategias de biología y de clonación PCR olecular (ver figura 1) 12. El BBS es 3 'de la GFP reportero sensible al pH, separadas por un enlazador alanina / ácido prolina 13-amino. Para el tráfico de los estudios descritos en esta publicación que se basan en muestras fijas, la pHGFP sirve como reportero del total etiquetado GABAAR los niveles de proteína de la subunidad, permitiendo la normalización del etiquetado Bgt población receptora de población total al receptor. Esto minimiza célula a célula Bgt tinción variabilidad de la señal resultante de la mayor o menor expresión basal de las subunidades GABAAR etiquetados. Además, la etiqueta pHGFP permite una fácil identificación de las células que expresan constructos para experimentos de imagen en vivo o fijos.
Introduction
El uso de acoplado con fluorescencia α-bungarotoxina para estudiar la localización del receptor y la dinámica fue pionera en los estudios del receptor de acetilcolina nicotínico 13-15, diana endógeno de la toxina. Posteriormente, la incorporación del péptido mínima Bgt de unión (BBS) se ha utilizado para estudiar el tráfico de ambos canales de iones excitatorios e inhibitorios mediados por ligandos y receptores acoplados a proteína G 2,10,16-21. Esta técnica basada en BBS ofrece ventajas a otros enfoques utilizados para estudios de tráfico, como los métodos de biotinilación superficie, el etiquetado de anticuerpos de células vivas con anticuerpos frente a epítopos extracelulares, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP). Durante superficie celular biotinilación aminas libres están covalentemente modificados, con el potencial de afectar la actividad celular. Los estudios basados en anticuerpos a menudo se han visto obstaculizados por la agrupación antígeno de superficie o de nivelación, lo que puede alterar los eventos de tráfico. Debido a la etapa de blanqueo para FRAP sos estudios, un asunto importante es dañar la estructura celular subyacente. Una ventaja adicional es que BBS etiquetada construcciones también se pueden utilizar para metodologías bioquímicas con el tráfico de biotina acoplada bungarotoxina a asnos del receptor. Esta técnica es fácilmente aplicable a líneas celulares y células primarias. Para uso en células que expresan nicotínicos de acetilcolina (nAChR), los receptores, el antagonista de nAChR tubocurarina debe ser utilizado en todo el protocolo como se indica. Realización de una Bgt etiquetado simple superficie (equivalente al punto de tiempo T = 0 para el protocolo de endocitosis) en las células no transfectadas en ausencia de tubocurarina proporcionará pruebas de nAChR endógeno.
Una consideración importante para el uso de esta técnica es la inserción apropiada de la BBS de modo que está presente en una localización extracelular cuando la proteína de interés se entrega a la membrana plasmática. Por ejemplo, los dominios N-terminales de las subunidades GABAAR residen en el lumen vesiculares durante el tráficofico y convertirse extracelular después de la inserción del receptor en la membrana plasmática, lo que permite un etiquetado específico de los receptores de la superficie celular y evaluación de su eliminación de la superficie celular por eventos endocítica. Hemos demostrado anteriormente que la adición de GFP, myc, o BBS epítopos a este dominio de subunidades GABAAR es funcionalmente silenciosa. Los controles estándar se deben realizar para asegurar que la proteína marcada se expresa en niveles similares a una construcción sin etiquetar, que localiza apropiadamente, y que no afecta a la función del receptor. Esta caracterización de las construcciones transfectadas también ayudará en las preocupaciones de sobreexpresión de solución de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas fijas y basadas BBS descritos aquí pueden ser utilizados para rastrear receptor u otra proteína de membrana de plasma trata de líneas de células, neuronas y otras células primarias. Este método ha sido utilizado con éxito para estudiar inserción en la membrana y la eliminación de canales iónicos activados por ligando y GPCR y evaluar los cambios en el tráfico debido a la presencia de agonistas de los receptores y moduladores. Los aspectos clave incluyen la localización apropiada de la etiqueta …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se prestó apoyo por inicio-fondos del Departamento de Farmacología y Biología Química de la Universidad de Pittsburgh Facultad de Medicina. El reconocimiento de los miembros del laboratorio de Jacob que contribuyeron a la presentación de vídeo: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
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