Med hjälp av en α-bungarotoxinbindning Site Tag att studera GABA A-receptorn Membran Lokalisering och människohandel
Summary
Här visar vi användningen av fluorescerande Alexa dye kopplad till α-bungarotoxin att mäta GABA A-receptorn yta lokaliseringen och endocytos i hippocampala neuroner. Genom att använda konstruktioner som bär en kort extracellulärt tagg som binder α-bungarotoxin, kan uppnås analys av plasmamembranprotein endocytic trafficking.
Abstract
Det är allt mer uppenbart att neurotransmittorreceptorer, inklusive jonotropa GABA A-receptorer (GABAAR), uppvisar mycket dynamisk handel och cellytan rörlighet 1-7. För att studera receptor på cellytan lokalisering och endocytos, den teknik som beskrivs här kombinerar användandet av fluorescerande α-bungarotoxin med celler som uttrycker konstruktioner som innehåller en α-bungarotoxin (Bgt) bindningsställe (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) är baserad på den α-subenheten av muskel-nikotinacetylkolinreceptorn, vilket binder Bgt med hög affinitet 8,9. Inkorporering av BBS webbplats tillåter ytan lokalisering och mätningar av receptor insättning eller borttagning med applicering av exogen fluorescerande Bgt, såsom tidigare beskrivits i spårning av GABAA och metabotropa GABAB-receptorer 2,10. Förutom den BBS sajten införas vi ett pH-känsligt GFP (pHGFP 11) mellan aminosyrorna 4 och 5 i det mogna GABAAR subenheten genom standard molecular biologi och PCR-kloningsstrategier (se figur 1) 12. BBS är 3 'av pH-känsliga GFP reporter, åtskilda av en 13-aminosyran alanin / prolin länkaren. För trafficking studier som beskrivs i denna publikation, som är baserade på fasta prover, pHGFP fungerar som en reporter av total tagged GABAAR subenhets-proteinnivåer, vilket tillåter normalisering av Bgt märkt receptor population till total receptorpopulationen. Detta minimerar cell till cell Bgt färgning signal variabilitet till följd av högre eller lägre baslinjen uttryck för de taggade GABAAR subenheter. Dessutom pHGFP taggen möjliggör enkel identifiering av konstruktion som uttrycker celler för live eller fasta avbildningsexperiment.
Introduction
Användningen av fluorescenskopplade α-bungarotoxin att studera receptorlokalisering och dynamik var uppfunnen vid studier av nikotinacetylkolinreceptorn 13-15, toxinet endogena mål. Därefter inkorporering av den minimala Bgt bindande peptid (BBS) har använts för att studera trafficking av både retande och hämmande ligandreglerade jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer 2,10,16-21. Denna BBS-baserad teknik ger fördelar till andra metoder som använts för människohandel studier liksom ytan biotinyleringen metoder, antikropps märkning av levande celler med antikroppar mot extracellulära epitoper, och fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP). Under cellytan Biotinylation fria aminer är kovalent modifierade, med potential att påverka cellaktiviteten. Antikropp baserade studier har ofta hämmats av ytantigen klustring eller tak, vilket kan förändra smugglingshändelser. På grund av att blekningssteget för FRAP studies, är en viktig angelägenhet att skada den underliggande cellstrukturen. En ytterligare fördel är att BBS taggade konstruktioner kan även användas för biokemiska metoder med biotin-kopplad bungarotoxin till åsnor receptor trafficking. Denna teknik är lätt tillämplig på cellinjer och primära celler. För användning i celler som uttrycker nikotinacetylkolin (nAChR)-receptorer, måste nAChR antagonisten tubokurarin användas i hela protokollet som anges. Utföra en enkel yta Bgt märkning (ekvivalent med T = 0 tidpunkt för endocytos protokoll) på otransfekterade celler i frånvaro av tubokurarin kommer att tillhandahålla bevis på endogen nAChR.
Ett viktigt övervägande för att använda denna teknik är lämplig insättning av BBS så att det är närvarande vid en extracellulär placering när proteinet av intresse levereras till plasmamembranet. Till exempel, de N-terminala domänerna av GABAAR subenheter uppehålla sig i de vesikulära lumen under tramänniskohandel och bli extracellulärt efter receptor införande i plasmamembranet, vilket gör att särskild märkning av receptorer på cellytan och bedömning av de avlägsnas från cellytan genom endocytiska händelser. Vi har tidigare visat att tillägg av GFP, myc, eller BBS epitoper till denna domän GABAAR subenheter är funktionellt tyst. Standard kontroller bör utföras för att se till att den taggade proteinet uttrycks på liknande nivåer till en omärkt konstruktion, att det på lämpligt lokaliserad, och att det inte påverkar receptorfunktionen. Denna karakterisering av transfekterade konstruktioner kommer också stöd i felsökning överuttryck oro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De BBS baserade fasta och levande metoder som beskrivs här kan användas för att spåra receptor eller annan plasmamembranprotein handel med cellinjer, nervceller och andra primära celler. Denna metod har framgångsrikt använts för att studera membran insättning och borttagning av ligandstyrda jonkanaler och GPCR och bedöma förändringar i handel på grund av närvaron av receptor-agonister och modulatorer. Viktiga aspekter innefattar lämplig lokalisering av taggen till ett extracellulärt plats och utföra kon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöd gavs av startup-medel från farmakologi och kemisk biologi Institutionen vid University of Pittsburgh School of Medicine. Bekräftelse av Jacob lab medlemmar som bidragit till video inlämnande: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
