GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı
Summary
Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.
Abstract
Bu giderek daha belirgin olduğunu İyonotropik GABA A reseptörleri (GABAAR), sergi derece dinamik kaçakçılığı ve hücre yüzey hareketliliği 1-7 gibi nörotransmitter reseptörleri. Hücre yüzeyi reseptör lokalizasyonu ve endositoz çalışma yapmak için, burada açıklanan teknik hücreler, bir α-bungarotoksin (Bgt) bağlama bölgesi (BBS) içeren yapıları ifade eden floresan α-bungarotoksinin kullanımını birleştirmektedir. BBS (WRYYESSLEPYPD) yüksek afinite ile 8,9 Bgt bağlanan kas nikotinik asetilkolin reseptörü, bir α alt birimi dayanmaktadır. BBS site dahil edilmesi, daha önce GABAA ve GABAB metabotropik takibi 2,10 reseptörleri de tarif edildiği gibi, yüzey lokalizasyonu ve alıcı ekleme veya eksojen floresan Bgt uygulama ile çıkarılması ölçümleri sağlar. BBS sitesine ek olarak, amino asitlerden 4 ve standart m tarafından olgun GABAAR alt biriminin 5 arasında bir pH-duyarlı bir GFP (pHGFP 11) takılıolecular biyoloji ve PCR klonlama stratejileri 12 (bkz. Şekil 1). BBS, bir 13-amino asit alanin / prolin bağlayıcı tarafından ayrılan, pH duyarlı GFP raportör, 3 'dir. Toplam bir muhabiri Bgt normalleşme toplam reseptör nüfusa reseptör nüfusu etiketli izin GABAAR altbirim düzeyde protein etiketlenmiş olarak sabit örnekleri dayalı bu yayında açıklanan çalışmalar kaçakçılığı için, pHGFP hizmet vermektedir. Bu etiketli GABAAR alt birimlerinin yüksek veya daha düşük bazal ifade kaynaklanan Bgt lekeleme sinyal değişkenliği hücre hücre en aza indirir. Ayrıca pHGFP etiketi canlı veya sabit görüntüleme deneyleri için yapı sentezleyen hücrelerin kolayca tanınmasını sağlar.
Introduction
Floresan reseptör lokalizasyonu ve dinamiklerini incelemek için α-bungarotoksin birleştirilmiş kullanımı, nikotinik asetilkolin reseptörü 13-15 toksinin endojen hedef çalışmalarda öncüleridir. Daha sonra, en az Bgt bağlayıcı peptid (BBS) dahil edilmesi hem de uyarıcı ve inhibitör ligand-kapılı iyon kanalları ve G protein birleştirilmiş alıcıların 2,10,16-21 kaçakçılığı incelemek için kullanılmıştır. Bu BBS-temelli bir yöntem, yüzey biyotinilasyon yöntemler, hücre-dışı epitopuna antikor canlı hücrelerin antikor etiketleme ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi ticareti çalışmalar için kullanılan diğer yaklaşımlara avantajlar sağlamaktadır. Hücre yüzeyinde sırasında biotinilasyon serbest aminler kovalent hücresel aktiviteyi etkileme potansiyeline sahip, modifiye edilir. Antikor bazlı çalışmalar genellikle kaçakçılığı olayları değiştirebilir yüzey antijeni kümeleme veya kapatması, engel olmuştur. Nedeniyle sıkı bağlamak s beyazlatma aşamasındantudies önemli bir endişe, altta yatan hücresel yapının zarar veriyor. Diğer bir avantaj BBS konstruktları da biotin ile birleştirilmiş eşek bungarotoksin reseptör ticareti biyokimyasal yöntemleri için kullanılabilir etiketli olmasıdır. Bu teknik, hücre hatları ve primer hücre kolayca uygulanabilir. Belirtildiği gibi nikotinik asetilkolin (nAChR) reseptörlerini eksprese eden hücrelerde kullanım için, nAChR antagonist tubokurarin protokol boyunca kullanılmalıdır. Tubokurarin yokluğunda transfekte edilmemiş hücrelerde (endositoz protokolü için T = 0 zaman noktası eşdeğer) basit bir yüzey Bgt etiketleme Sahne endojen nAChR'nin kanıt sağlar.
Bu ilgilenilen protein plazma zarının teslim edilir hücre dışı bir konumda mevcut olduğu için bu tekniği kullanarak için önemli bir faktör, BBS uygun yerleştirilmesini içerir. Örneğin, GABAAR alt birimlerin N-terminal etki alanları prose sırasında veziküler lümen ikametticaretine ve hücre yüzeyi reseptörlerine ve endositik olayların hücre yüzeyinden kendi kaldırma değerlendirmesi belli etiketleme sağlayan, plazma zarında reseptör yerleştirilmesi sonra hücre-dışı hale gelir. Daha önce GFP, myc veya BBS eklenmesinin GABAAR alt birimlerin bu etki için epitoplarını göstermiştir ki, işlevsel olarak sessizdir. Standart kontrol uygun şekilde lokalize olduğunu ve etiketli protein, bir etiketlenmemiş yapısına benzer seviyelerde ifade olduğundan emin olmak için gerçekleştirilmiştir ve bu reseptör fonksiyonunu etkilemez edilmelidir. Transfekte yapıları Bu karakterizasyonu da sorun overekspresyonu kaygıları yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan BBS göre sabit ve canlı teknikleri reseptörü veya hücre hatları, nöronlar ve diğer primer hücrelerde diğer plazma zar proteini kaçakçılığı izlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, başarılı bir zar yerleştirilmesi ve ligand-kapılı iyon kanalları ve GPCR çıkarılmasını çalışma nedeniyle reseptör agonistleri ve modülatörlerinin varlığında sirkülasyondan değişiklikleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Anahtar açıdan uygun bir hücre dışı bir konuma et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Destek Tıp Pittsburgh Üniversitesi Okulu'nda Farmakoloji ve Kimya Biyoloji Bölümü'nden başlangıç fonlar tarafından sağlanmıştır. Nicholas Graff: video gönderme katkıda Jacob laboratuvar üyeleri tanınması.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
