एक में विवो Crosslinking दृष्टिकोण ड्रोसोफिला भ्रूण
Summary
बहु घटक प्रोटीन परिसरों सेलुलर समारोह और विकास के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम में विवो crosslinking बाद संरचना समारोह विश्लेषण के लिए Crosslinked परिसरों की शुद्धि के बाद के बाद भ्रूण ड्रोसोफिला से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की विधि का वर्णन है.
Abstract
कई सेलुलर प्रक्रियाओं multisubunit प्रोटीन परिसरों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. अक्सर इन परिसरों क्षणिक फार्म और इकट्ठा करने के लिए देशी वातावरण की आवश्यकता होती है. इसलिए, इन कार्यात्मक प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए, यह सेल और बाद शुद्धि से पहले विवो में उन्हें स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम ड्रोसोफिला भ्रूण से बड़े सदाशयी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की विधि का वर्णन है. इस विधि आसानी से कोशिका झिल्ली को पार कर सकते हैं जो formaldehyde के एक कम एकाग्रता, का उपयोग करने में विवो crosslinking द्वारा भ्रूण के अंदर परिसरों की भ्रूण permeabilization और स्थिरीकरण पर आधारित है. बाद में, ब्याज की प्रोटीन जटिल जेल शुद्धि द्वारा पीछा किया और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण immunopurified है. हम germline विकास के लिए आवश्यक है, जो एक ट्यूडर प्रोटीन जटिल है, की शुद्धि का उपयोग इस विधि को वर्णन. छोटे – ट्यूडर कई ट्यूडर डोमेन शामिल हैं जो एक बड़े प्रोटीन, हैलक्ष्य प्रोटीन की methylated arginines या lysines के साथ बातचीत कि मॉड्यूल. इस विधि विभिन्न जीवों और ऊतकों से देशी प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
Multisubunit प्रोटीन विधानसभाओं और डीएनए या आरएनए प्रोटीन परिसरों के अलगाव प्रोटीन परिसरों, डीएनए बाध्यकारी नियामक प्रोटीन या शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की शाही सेना लक्ष्य द्वारा मान्यता प्राप्त जीनोमिक loci की पहचान करने के लिए किया जाता है. विभिन्न तरीकों से किसी दिए गए शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (क्लिप seq) 2 के साथ जुड़े प्रतिलेखन कारक या chromatin प्रोटीन (चिप seq) 1 और आरएनए लक्ष्य द्वारा मान्यता प्राप्त डीएनए साइटों के जीनोम चौड़ा पहचान की अनुमति. शाही सेना व्युत्पन्न cDNAs या डीएनए लक्ष्य के पुस्तकालयों फिर गहरा अनुक्रम रहे हैं. इन विधियों रासायनिक या यूवी प्रेरित अध्ययन परिसर के एक प्रोटीन घटक के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation (आईपी) के बाद परिसरों को स्थिर करने के लिए पार से जोड़ने का उपयोग करें.
एक जीव के विकास के दौरान, कई प्रोटीन परिसरों क्षणिक रूप में. इसलिए, यह देव है कि नियंत्रण आणविक तंत्र को समझने के लिए vivo में इन परिसरों की संरचना और समारोह का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण हैelopment. यह बातचीत के घटकों और इन विट्रो में सेलुलर जैव रासायनिक पर्यावरण के देशी सांद्रता पुन: पेश करने के लिए लगभग असंभव है, क्योंकि इस तरह के एक Vivo विश्लेषण में इन विट्रो दृष्टिकोण से बेहतर होगा. यहाँ हम हम सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला भ्रूण से बड़े प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक Vivo दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. इस विधि में, रहने वाले भ्रूण में प्रोटीन परिसरों एक कम formaldehyde की एकाग्रता और बाद में ब्याज की प्रोटीन परिसरों परिसरों और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की जेल शुद्धि के बाद परिसरों की एक ज्ञात घटक के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ आईपी से अलग कर रहे हैं के साथ Crosslinked रहे हैं अज्ञात जटिल घटकों की पहचान. Formaldehyde कोशिका झिल्ली तर करने में सक्षम है और 2.3-2.7 3 के एक crosslinking रेंज है के बाद से, प्रोटीन परिसरों विवो में Crosslinked किया जा सकता है और जटिल घटकों एक दूसरे के करीब होने की संभावना है. इस लेख में हम मेंएक उदाहरण के रूप में ट्यूडर (TUD) प्रोटीन परिसर के अलगाव का उपयोग इस विधि का वर्णन. TUD germline विकास 4-7 के लिए आवश्यक है, जो एक germline प्रोटीन होता है. इस प्रोटीन अन्य polypeptides 8-10 की methylated arginines या lysines के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है 11 TUD डोमेन शामिल हैं.
इससे पहले, हम कार्यात्मक TUD 5 हेक्टेयर टैग व्यक्त करता है और इसलिए, विशिष्ट विरोधी हा एंटीबॉडी crosslinking के बाद TUD जटिल नीचे खींचने के लिए प्रयोग किया जाता है जो एक ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइन उत्पन्न किया है.
प्रोटीन, प्रोटीन crosslinks के अलावा, formaldehyde न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन crosslinks उत्पन्न कर सकते हैं और चिप seq प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा, ड्रोसोफिला में, formaldehyde के साथ crosslinking विवो में वासा शाही सेना helicase प्रोटीन 11 के एक शाही सेना लक्ष्य की पहचान की अनुमति दी है.
इस लेख में हम में विवो crosslinking और पुर के लिए एक विधि का वर्णन करते समयड्रोसोफिला भ्रूण से प्रोटीन परिसरों की ification, इस विधि अन्य जीवों और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehyde सामान्यतः प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत की पहचान करने के लिए एक crosslinking अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया है. एक साथ नीचे की ओर मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रक्रियाओं के साथ संगतत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन के साथ उनके तकनीकी सहायता के लिए जॉर्डन डेविस, Yanyan लिन, एरिक Schadler और Jimiao झेंग धन्यवाद. इस काम ALA MCB-1054962 अनुदान NSF कैरियर द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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