Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo's
Summary
Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.
Abstract
Vele cellulaire processen gestuurd door multisubunit eiwitcomplexen. Veel van deze complexen tijdelijk en vereisen natuurlijke omgeving te monteren. Daarom, om deze functionele eiwitcomplexen identificeren, is het belangrijk om stabilisatie in vivo voor cellysis en daaropvolgende zuivering. Hier beschrijven we een methode om grote bonafide eiwitcomplexen van Drosophila embryo's te isoleren. Deze methode is gebaseerd op embryo permeabilisatie en stabilisatie van de complexen in de embryo's door in vivo verknoping met een lage concentratie van formaldehyde, die gemakkelijk de celmembraan kan oversteken. Vervolgens wordt het eiwitcomplex plaats immuungezuiverd gevolgd door gel zuivering en geanalyseerd door massaspectrometrie. We illustreren deze methode gebruik zuivering van een Tudor eiwitcomplex, dat essentieel is voor kiemlijn ontwikkeling. Tudor is een groot eiwit, die meerdere Tudor domeinen bevat – kleinmodules die samenwerken met gemethyleerd arginines of lysinen van target eiwitten. Deze methode kan worden aangepast voor isolatie van natieve eiwitcomplexen van verschillende organismen en weefsels.
Introduction
Isolatie van multisubunit verzamelingen van eiwitten en DNA-of RNA-eiwitcomplexen wordt uitgevoerd om eiwitcomplexen, genomische loci die door DNA-bindende regulatorische eiwitten of RNA doelwitten RNA-bindende eiwitten te identificeren. Verschillende methoden is het mogelijk genoom-brede identificatie van DNA-sites herkend door transcriptiefactoren of chromatine-eiwitten (ChIP-seq) 1 en RNA targets gekoppeld aan een bepaalde RNA-bindend eiwit (CLIP-volgende) 2. De bibliotheken van RNA afkomstig cDNA of DNA doelen worden vervolgens diep sequentie. Deze methoden gebruiken chemische of UV geïnduceerde verknoping de complexen gevolgd door immunoprecipitatie (IP) stabiliseren met een antilichaam tegen een eiwit component van het onderzochte complex.
Tijdens de ontwikkeling van een organisme, veel eiwitcomplexen vormen transiënt. Daarom is het cruciaal om de samenstelling en functie van deze complexen in vivo analyse om de moleculaire mechanismen die dev beheersen begrijpeneling. Een dergelijke in vivo analyse superieur in vitro benadering is want het is vrijwel onmogelijk om natieve concentraties van de interagerende componenten en cellulaire biochemische omgeving vitro reproduceren. Hier laten we een in vivo benadering die we met succes gebruikt om grote eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's. In deze werkwijze worden eiwitcomplexen in levende embryo verknoopt met een lage concentratie van formaldehyde en vervolgens eiwitcomplexen plaats worden geïsoleerd door IP met een antilichaam tegen een bekende component van de complexen gevolgd door gel zuivering van de complexen en massaspectrometrie analyse identificeren onbekende complexe componenten. Aangezien formaldehyde kan de celmembraan doordringen en heeft een verknopende bereik van 2,3-2,7 A 3 kunnen eiwit complexen worden verknoopt in vivo en complexe componenten waarschijnlijk dicht bij elkaar bevinden. In dit artikel gaan webeschrijven deze werkwijze met de isolatie van Tudor (Tud) eiwitcomplex als voorbeeld. Tud een kiemlijn eiwit dat essentieel is voor kiembaan ontwikkeling 4-7. Dit eiwit bevat 11 Tud domeinen bekend om te interageren met brandspiritus arginines of lysinen van andere polypeptiden 8-10.
Eerder hebben we een transgene Drosophila lijn die uitdrukt HA-tag functionele Tud 5 en daarom wordt specifieke anti-HA-antistoffen gebruikt om pull-down Tud complex na verknoping gegenereerd.
Naast de eiwit-eiwit verknopingen kunnen formaldehyde nucleïnezuur-eiwit crosslinks genereren en wordt gebruikt ChIP-seq experimenten. Verder in Drosophila, in vivo verknoping met formaldehyde kon de identificatie van een RNA-doel van Vasa RNA helicase-eiwit 11.
Terwijl in dit artikel beschrijven we een methode voor in vivo verknoping en purcatie van eiwitcomplexen van Drosophila embryo, kan deze methode worden aangepast voor andere organismen en weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehyde is vaak gebruikt als een verknopende reagens voor het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties. De goede oplosbaarheid en celmembraan permeabiliteit, alsmede de verenigbaarheid met stroomafwaartse massaspectrometrie procedures maken formaldehyde een ideale kandidaat middel voor verknoping intracellulaire toepassingen 3,15-17. In het bijzonder werd met succes gebruikt om mRNA's geassocieerd met Vasa, een kritische kiemcel RNA helicase in Drosophila 11</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler en Jimiao Zheng voor hun technische hulp bij deze studie. Dit werk werd ondersteund door NSF CARRIERE verlenen MCB-1054962 om ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
