Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons
Summary
Complexes de protéines multi-composants jouent un rôle crucial lors de la fonction cellulaire et le développement. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler des complexes de protéines natives à partir d'embryons de Drosophila après réticulation in vivo suivie d'une purification des complexes réticulés pour analyse subséquente structure-fonction.
Abstract
De nombreux processus cellulaires sont contrôlées par des complexes protéiques unités multiples. Souvent, ces complexes forment transitoire et nécessitent environnement natif à assembler. Par conséquent, afin d'identifier ces complexes de protéines fonctionnelles, il est important de les stabiliser in vivo avant la lyse des cellules et la purification ultérieure. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler de grands complexes de protéines de bonne foi à partir d'embryons de Drosophila. Cette méthode est basée sur l'embryon perméabilisation et la stabilisation des complexes à l'intérieur des embryons par reticulation in vivo en utilisant une faible concentration en formaldéhyde, qui peut facilement traverser la membrane cellulaire. Par la suite, le complexe de protéine d'intérêt est immunopurifié suivie d'une purification sur gel et analysés par spectrométrie de masse. Nous illustrons cette méthode en utilisant la purification d'un complexe protéique Tudor, qui est essentielle pour le développement de la lignée germinale. Tudor est une grosse protéine, qui contient plusieurs domaines Tudor – petitmodules qui interagissent avec arginines méthylées ou des lysines des protéines cibles. Cette méthode peut être adaptée pour l'isolement des complexes de protéines natives provenant d'organismes différents et des tissus.
Introduction
Isolement des assemblages de protéines unités multiples et complexes d'ADN-ou d'ARN-protéine est effectuée pour identifier des complexes de protéines, des loci génomiques reconnu par des protéines de régulation se liant à l'ADN ou des cibles d'ARN des protéines de liaison d'ARN. Différents procédés permettent l'identification de l'ensemble du génome d'ADN des sites reconnus par des facteurs de transcription ou des protéines de la chromatine (ChIP-seq) 1 et les cibles d'ARN associés à une protéine de liaison à l'ARN donné (CLIP-seq) 2. Les bibliothèques d'ADNc de l'ARN dérivé ou de cibles d'ADN sont ensuite profondément séquences. Ces procédés utilisent des produits chimiques ou de réticulation pour stabiliser les complexes suivie par une immunoprécipitation (IP) avec un anticorps dirigé contre un composant protéique du complexe étudié induite par les UV.
Au cours du développement d'un organisme, de nombreux complexes protéiques forment de manière transitoire. Par conséquent, il est essentiel d'analyser la composition et le fonctionnement de ces complexes in vivo pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent developpement. Une telle analyse in vivo serait supérieure à l'approche in vitro car il est pratiquement impossible de reproduire les concentrations indigènes des éléments en interaction et de l'environnement biochimique cellulaire in vitro. Ici, nous démontrons une approche in vivo que nous utilisons avec succès pour isoler grands complexes de protéines à partir d'embryons de drosophile. Dans ce procédé, les complexes de protéines dans les embryons vivants sont réticulés avec une faible concentration en formaldéhyde et ensuite complexes de protéines d'intérêt sont isolés par IP avec un anticorps dirigé contre un composant connu des complexes, suivie d'une purification sur gel des complexes et de l'analyse par spectrométrie de masse à identifier les composants complexes inconnus. Etant donné que le formaldéhyde est capable de traverser la membrane cellulaire et a une gamme de réticulation de 02.03 à 02.07 Å 3, des complexes de protéines peuvent être réticulés in vivo et les composants complexes sont susceptibles d'être proches les unes des autres. Dans cet article, nousdécrire ce procédé en utilisant l'isolement de Tudor (TUD) complexe de protéines, par exemple. Tud est une protéine de la lignée germinale qui est essentiel pour le développement de la lignée germinale 4-7. Cette protéine contient 11 domaines TUD connus pour interagir avec les arginines ou lysines méthylées d'autres polypeptides 8-10.
Auparavant, nous avons généré une ligne drosophile transgénique qui exprime HA-étiqueté Tud fonctionnelle 5 et donc, un anticorps spécifique anti-HA est utilisé pour tirer vers le bas complexe Tud après réticulation.
En plus des réticulations protéine-protéine, le formaldéhyde peut générer des réticulations d'acide nucléique-protéine et est utilisé dans des expériences de ChIP-seq. En outre, chez la drosophile, in vivo de réticulation avec le formaldéhyde a permis l'identification d'une cible d'ARN de l'ARN Vasa protéine hélicase 11.
Bien que dans cet article, nous décrivons un procédé pour la reticulation in vivo et purification des complexes de protéines à partir d'embryons de Drosophila, ce procédé peut être adapté à d'autres organismes et les tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le formaldehyde a été couramment utilisé comme réactif de réticulation pour identifier la protéine-protéine et des interactions protéine-acide nucléique. Sa bonne solubilité et la perméabilité membranaire de la cellule, ainsi que la compatibilité avec les procédés de spectrométrie de masse en aval, de faire un formaldéhyde agent candidat idéal pour les applications de reticulation intracellulaires 3,15-17. En particulier, il a été utilisé avec succès pour identifier les ARNm associés à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler et Jimiao Zheng pour leur aide technique à cette étude. Ce travail a été soutenu par la NSF Career Grant MCB-1054962 ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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