アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚
Summary
多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。
Abstract
多くの細胞プロセスは、マルチサブユニットタンパク質複合体によって制御される。頻繁にこれらの複合体は、一過性に形成し、組み立てるためにネイティブ環境が必要です。したがって、これらの機能性タンパク質複合体を同定するためには、細胞溶解およびその後の精製の 前に、生体内でそれらを安定化することが重要である。ここでは、 ショウジョウバエの胚から大真正タンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。この方法はin vivoで容易に細胞膜を通過することができ、低濃度のホルムアルデヒドを用いて架橋することによって、胚の内側の複合体の胚の透過化と安定化に基づいている。続いて、関心対象のタンパク質複合体は、ゲル精製し、そして質量分析によって分析免疫精製される。我々は、生殖系列発達のために必須であるチューダータンパク質複合体の精製を使用してこの方法を説明する図である。チューダーは、複数のチューダードメインを含む大規模なタンパク質である – 小さな標的タンパク質のメチル化アルギニンまたはリジンと対話モジュール。この方法は、異なる生物及び組織由来の天然タンパク質複合体の単離のために適合させることができる。
Introduction
マルチサブユニットタンパク質アセンブリおよびDNA-又はRNA-タンパク質複合体の単離は、タンパク質複合体、DNA結合性調節タンパク質又はRNA結合タンパク質のRNA標的によって認識される、ゲノム遺伝子座を同定するために行われる。別の方法は、転写因子またはクロマチンタンパク質（のChIP-seqの）1と所与のRNA結合タンパク質（CLIP-seqの）2に関連するRNA標的によって認識されるDNA部位のゲノムワイドな同定を可能にする。 RNA由来のcDNAまたはDNA標的のライブラリーは、その後、深く配列決定される。これらの方法には、化学的またはUV誘導に研究複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いて免疫沈降（IP）に続いて複合体を安定させるために、架橋を使用しています。
生物の開発中に、多くのタンパク質複合体を一過形成する。したがって、デベロッパーを制御する分子メカニズムを理解するために、インビボでのこれらの複合体の組成および機能を分析することが重要であるelopment。それは、in vitroで相互作用する成分の本来の濃度と細胞生化学的環境を再現することは事実上不可能であるため、このようなin vivoでの解析は、in vitroでのアプローチよりも優れているでしょう。ここでは、我々は成功してショウジョウバエの胚から、大きなタンパク質複合体を分離するために使用して、生体内のアプローチを示しています。この方法では、生きている胚におけるタンパク質複合体は、低濃度のホルムアルデヒドで架橋され、続いて、目的のタンパク質複合体は、複合体のゲル精製に続いて複合体の既知の成分と質量分析を用いてIPに対する抗体によって単離される未知の複雑なコンポーネントを識別します。ホルムアルデヒドは、細胞膜を透過することができ、2.3〜2.7オングストローム3の架橋範囲を有するので、タンパク質複合体は、 インビボで架橋することができ、複雑な構成要素は、互いに近い可能性が高い。この記事の我々にある一例としてチューダー（TUD）タンパク質複合体の単離を使用してこの方法を説明する。 TUDは生殖細胞の発達4-7に不可欠である生殖細胞タンパク質である。このタンパク質は、他のポリペプチド8月10日のメチル化アルギニンまたはリジンと相互作用することが知られ11 TUDドメインを含む。
先に、我々は、機能TUD 5 HA-タグ化発現し、従って、特異的な抗HA抗体を架橋後TUD錯体をプルダウンするために用いられるトランスジェニックショウジョウバエ株を生成されている。
タンパク質 – タンパク質架橋に加えて、ホルムアルデヒドは、核酸 – タンパク質架橋を生成することができるとのChIP-seqの実験で使用されている。さらに、 ショウジョウバエにおいて、ホルムアルデヒドと架橋インビボでヴァーサRNAヘリカーゼタンパク質11のRNA標的の同定を可能にした。
この記事では、生体内架橋およびPURのための方法を説明しながら、ショウジョウバエ胚由来のタンパク質複合体のification、この方法は、他の生物および組織に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ホルムアルデヒドは、一般的に、タンパク質 – タンパク質及びタンパク質 – 核酸相互作用を同定するための架橋剤として使用されている。一緒に下流の質量分析手法との互換性との良好な溶解性および細胞膜透過性は、ホルムアルデヒド、細胞内架橋アプリケーション3,15-17のための理想的な候補薬剤を作る。特に、正常ヴァーサ、 ショウジョウバエ 11において重要な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この研究とその技術のヘルプはジョーダン·デイビス、ヤンヤン林、エリックSchadlerさんとJimiao鄭に感謝します。この作品は、AlaへのMCB-1054962を付与NSFのキャリアによってサポートされていました
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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