הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים
Summary
התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.
Abstract
התגובה החיסונית המארח לפתוגנים היא תהליך ביולוגי מורכב. רוב במחקרי vivo מועסק קלסי לאפיין אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן לנצל את זריקות intraperitoneal של חיידקים בחרו או דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs) בעכברים. בעוד טכניקות אלה הניבו נתונים עצומים הקשורים pathobiology מחלות זיהומיות, מודלים זריקת intraperitoneal הם לא תמיד מתאימים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן בריאות. ניצול מודל דלקת ריאות חריף בעכברים, ניתן לבצע ניתוח ברזולוציה גבוה של מארח תגובה חיסונית מולדת ניצול lipopolysaccharide (LPS). כאן, אנו מתארים את השיטות לניהול LPS באמצעות ממשל intratracheal הלוע התחתון לא נזקק לניתוח, לעקוב אחר פרמטרים קליניים הקשורים להיווצרות מחלה, ולנצל את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית כדי להעריך את התגובה החיסונית המארחת. הטכניקות המתוארותחלים נרחב ללימוד התגובה החיסונית המולדת המארח למגוון רחב של PAMPs ופתוגנים. כמו כן, עם שינויים קלים, יכולות להיות מיושמות גם בטכניקות אלה במחקרים להערכת דלקת בדרכי הנשימה ואלרגיות ביישומים תרופתיים.
Introduction
דלקות ריאה הקשורים למיני חיידקים פתוגניים הם גורמים שכיחים לתחלואה ותמותה בעולם. קביעת המנגנונים המניעים את התגובה החיסונית המארחת לפתוגנים אלה יהיו לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות חדשניות למניעה וסוכנים טיפוליים שיהיה להחליש את ההשפעה של זיהומים אלה. המטרה הכללית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק את המשתמש עם שיטה גמישה כדי להעריך את התגובה החיסונית המולדת המארח לזיהום הפתוגן באמצעות דפוס הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMP) כתחליף לחיידקים חיים. רוב המחקרים הקודמים להערכת התגובה החיסונית המולדת לחיידקי המארח התמקדו בדגמי הצפק בשל הקלות היחסית של ביצוע. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד והביאו להתקדמות משמעותית בתחום של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ודלקת מערכתית, הנתונים המופקים ממודלים אלה לא תמיד מתאימים ללימודים involving מערכת הנשימה. הנה, מודל ריאות של דלקת ריאות חריפה מוצע כהרחבה מעשית ורלוונטית קליני של המודלים הזרקה (IP) intraperitoneal הקלאסיים. הטכניקה המוצעת מאפשרת להערכה המקומית של תגובת החיסון המולדת במערכת מודל ספציפית איברים.
השיטות שתוארו כאן נועדו לספק טכניקה פשוטה וחזקה כדי לאפשר למשתמשים להעריך את התגובה החיסונית המארחת לLPS, שהוא PAMP משותף. השיטות מבוססות על intratracheal החדרה (את זה) של LPS, אשר גורם לתגובה חיסונית מולדת חזקה לריאות של עכברים ומחקה רבים מהתכונות pathophysiological נצפו בחולים אנושיים הסובלים מזיהומים בדרכי הנשימה ופציעת ריאות חריפות 1. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש להעריך את התגובה החיסונית המארחת בלי גורמי בלבול וחששות בטיחות הקשורים לביצוע במחקרי vivoשימוש בחיידקים חיים. כמו כן, יש מסלול ממשלו הלוע התחתון של חשיפה שתוארה בפרוטוקול זה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות מנוצלים בדרך כלל, כוללים אפי (ב) ממשל ומנהלו כירורגית. לדוגמא, ממשלו הלוע התחתון מאפשר dosaging מדויק יחסית ותצהיר ריאות בהשוואה בממשל, אשר בדרך כלל סובל מהשתנות מוגברת של תצהיר ריאות עקב האובדן של סוכנים בחלל האף והסינוסים 2-4. מסלול הממשל עוקף חללים אלו ומאפשר גישה ישירה לקנה הנשימה ודרכי הנשימה. כמו כן, גישתה כירורגית היא שיטת ממשל באופן משמעותי יותר חולנית ודורשת הכשרה מקיפה להורים. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים גם תיאור טכניקות הנפוצות וסמנים פונדקאיות המשמשים להערכת התקדמות דלקת ומסתיים בפרוטוקול המתאר את הטכניקות המתאימות להכנת luNGS להערכות histopathology. פרוטוקולים אלה התמקדו במזעור מספר העכברים הנדרשים לכל מחקר על ידי למקסם את הנתונים המופקים מבעלי חיים הבודדים.
הפרוטוקולים שתוארו הם גמישים ביותר וניתן לשנות בקלות להעריך PAMPs מגוון רחב ודפוסי נזקים הקשורים מולקולריים (damps). יתר על כן, עם כמה שינויים נוספים, יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים אלה למחקרים להערכת התקדמות מחלה בדרכי הנשימה אלרגיות או אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן עם חיידקים חיים, וירוסים או פטריות 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר להערכת התגובה החיסונית המארחת בריאות עכבר בהצלחה הוא כדלקמן: 1) לבחור את הזן המתאים עכבר ומין עבור הדגם נבדק; 2) לייעל את משלוח PAMP לריאות; 3) בצורה נכונה לאסוף ולעבד את בלף; ו -4) לתקן כראוי ולהכין של הריאות להערכות histopathological.
<p class="jove_content" style=";text-align…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למכללה האזורית VA-MD ברפואת וטרינרית למתן תמיכת ליבה וטכנית עבור פרויקט זה. עבודה זו נתמכת על פיתוח קריירה פרס NIH (K01DK092355) על ידי.
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
