Summary

والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران

Published: April 02, 2014
doi:

Summary

استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.

Abstract

استجابة المضيف المناعي لمسببات الأمراض هو عملية بيولوجية معقدة. غالبية العاملين في الدراسات المجراة كلاسيكي لتوصيف التفاعلات المضيف الممرض الاستفادة من الحقن داخل الصفاق من البكتيريا أو الممرض حدد المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) في الفئران. في حين أن هذه التقنيات قد أسفرت عن البيانات الهائلة المرتبطة البيولوجيا المرضية الأمراض المعدية، ونماذج حقن داخل الصفاق ليست دائما ملائمة للدراسات التفاعل المضيف الممرض في الرئة. استخدام نموذج التهاب الرئة الحادة في الفئران، فمن الممكن إجراء تحليل عالية الدقة للمضيف الاستجابة المناعية الفطرية باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS). هنا، نحن تصف الأساليب لإدارة LPS استخدام غير الجراحية الإدارة داخل القصبة الهوائية والبلعوم، ورصد المعلمات السريرية المرتبطة المرضية المرض، والاستفادة من السائل غسل القصبات لتقييم الاستجابة المناعية المضيف. التقنيات التي تم وصفهاقابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة لمجموعة متنوعة من PAMPs ومسببات الأمراض. وبالمثل، مع تعديلات طفيفة، وهذه التقنيات يمكن أن تطبق أيضا في دراسات تقييم التهاب الشعب الهوائية التحسسي والتطبيقات الدوائية.

Introduction

الالتهابات الرئوية المرتبطة بالأنواع البكتيريا المسببة للأمراض هي سبب شائع للمراضة والوفيات في العالم. وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المضيف المناعية لهذه الجراثيم تعزيز تنمية استراتيجيات الوقاية الرواية والعوامل العلاجية التي من شأنها أن تخفف من وقع هذه الالتهابات. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير للمستخدم مع طريقة مرنة لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للإصابة الممرض باستخدام الممرض المرتبطة نمط الجزيئية (PAMP) كبديل للبكتيريا حية. وقد ركزت معظم الدراسات السابقة تقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للبكتيريا على نماذج البريتوني بسبب السهولة النسبية التنفيذ. في حين أن هذه النماذج مفيدة للغاية وأدت إلى تقدم كبير في مجال التفاعلات المضيف الممرض والتهاب النظامية، والبيانات الناتجة من هذه النماذج ليست دائما ملائمة للدراسات involviنانوغرام الجهاز التنفسي. هنا، يقترح نموذجا الرئوي التهاب الرئة الحاد كما توسع عملية وذات الصلة سريريا من النماذج الكلاسيكية حقن داخل الصفاق (IP). تقنية المقترح يسمح للتقييم المحلي للاستجابة المناعية الفطرية في نظام الجهاز نموذج محدد.

وقد صممت الطرق الموضحة هنا لتوفير تقنية بسيطة وقوية للسماح للمستخدمين لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف LPS، وهو PAMP المشتركة. وتستند طرق على داخل الرغامى (ذلك) من تقطير LPS، والذي يؤدي الى الاستجابة المناعية الفطرية قوية في الرئتين من الفئران ويقلد الكثير من الميزات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي وإصابة الرئة الحادة 1. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يتيح للمستخدم لتقييم الاستجابة المناعية المضيف دون عوامل خارجية ومخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بإجراء الدراسات المجراةاستخدام البكتيريا الحية. وبالمثل، فإن الفم والبلعوم الطريق الادارة انها التعرض الموصوفة في هذا البروتوكول لديه مزايا هامة على التقنيات المستخدمة عادة أخرى، بما في ذلك الأنف (في) الإدارة والإدارة أنه الجراحية. على سبيل المثال، الادارة انها البلعوم يسمح dosaging دقيقة نسبيا وترسب الرئة مقارنة في الإدارة، الذي يعاني عادة من زيادة تقلب ترسب الرئة بسبب فقدان وكلاء في تجويف الأنف والجيوب 2-4. الطريق الادارة انها تلتف هذه التجاويف ويتيح الوصول مباشرة إلى القصبة الهوائية والشعب الهوائية. وبالمثل، فإن النهج الذي الجراحية هو أسلوب الإدارة بشكل ملحوظ أكثر المهووسين ويتطلب التدريب المكثف لإتقان. وتشمل البروتوكولات وصفها هنا أيضا وصفا لتقنيات مشتركة وعلامات بديلة تستخدم لتقييم تطور التهاب وينتهي بروتوكول يصف التقنيات المناسبة لإعداد لوخ ع لتقييم التشريح المرضي. وتركز هذه البروتوكولات على التقليل من عدد من الفئران المطلوبة لكل دراسة من خلال تعظيم البيانات المتولدة من كل حيوان على حدة.

البروتوكولات وصفها مرنة للغاية ويمكن تعديلها بسهولة لتقييم PAMPs مجموعة متنوعة والأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). علاوة على ذلك، مع بضعة تعديلات إضافية، هذه البروتوكولات يمكن أن تطبق أيضا على دراسات تقييم مجرى الهواء حساسية تطور المرض أو التفاعلات المضيف الممرض مع البكتيريا الحية أو الفيروسات أو الفطريات 5-10.

Protocol

أجريت جميع الدراسات بموجب موافقة لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) لجامعة فرجينيا للتكنولوجيا وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. داخل الرغامى (عليه) تلقيح LPS طريق إدارة البلعوم <ol style=…

Representative Results

وتتكون جدران الخلايا من البكتيريا سالبة الجرام من LPS، والتي هي وفيرة للغاية في البيئة. استنشاق LPS في التجمعات البشرية حساسة يزيد من تفاقم تفاعل مجرى الهواء، وقادر على إحداث response11 مناعية قوية. LPS هو أيضا PAMP الشائعة المستخدمة في نماذج الماوس لاستثارة الاستجابة المناعية…

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لتقييم بنجاح استجابة المضيف المناعية في الماوس الرئتين هي كما يلي: 1) اختيار سلالة الفأر المناسبة والجنس لنموذج يجري تقييمها؛ 2) تحسين تسليم PAMP إلى الرئتين؛ 3) جمع بشكل صحيح ومعالجة BALF؛ و4) إصلاح بشكل صحيح وإعداد الرئتين لتقييم التشريحية المرضية. </p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر كلية VA-MD الإقليمي للطب البيطري لتوفير الأساسية والدعم التقني لهذا المشروع. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح التطوير المهني (K01DK092355).

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

Play Video

Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

View Video