우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리 photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 검출 현대 생물학 및 의료 애플리케이션에서 사용 많은 널리 활용하고 신속하게 진행 현미경 기술에 대한 기반을 제공합니다. 형광의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상과의 호환성이 (가) 있습니다. 불행하게도, 형광 현미경의 전통적인 형태 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 영상 평면에서 하나의 주요 약점, 회절 제한 해상도에서 고통. 최근, 이러한 제한은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM)와 같은 초 고해상도 형광 현미경 기술의 도입으로 극복하고있다. 는 기존의 대응과는 달리, PALM은 수십 나노 미터의 측면 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다. 그것은 세포의 구조 및 조직의 이전에 액세스 할 수없는 속성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다. _content "> 불행히도, PALM 구현하기 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다.이 문서에서는, 우리는 고정 된 배양 된 신경 세포의 기공을 갖는 구조의 단일 색상 PALM 연구를 구현하는 방법을 보여줍니다. PALM은 이상적으로 50 ~ 250 nm의 ~에서. 우리의 접근의 주요 단계를 포함 일반적으로 범위 치수가 소포의 연구에 적합와 간헐적 샘플링 RAW 이미지를 수집, photoconvertible (빨강 녹색) 소포화물의 키메라와 신경 세포를 라벨 수퍼 - 해상도 현미경 시스템, 고해상도 PALM 화상을 생성하는 것의 이미지를 처리. 또한 반박되는 배양 된 해마 뉴런 고밀도 코어 소포 매우 잘 해결 이미지 (DCVs)을 제시하여 우리의 접근 방법의 효능을 입증 DCVs의 extrasynaptic 매매는 DCV 클러스터에 의해 주로 매개되는 가설.
서론
세포 프로세스의 숫자는 특정 세포 내 목적지로 생체 분자의 정확하고 효율적인 소포 - 중재 인신 매매에 따라 달라집니다. 한 가지 눈에 띄는 예는 잠재적으로 말초 사전 및 시냅스 사이트 1에 신경 소마의 생합성의 사이트에서 시냅스 성분의 긴 원거리, 소포 - 중재 배달로 시작되는 시냅스 어셈블리입니다.
형광 현미경 소포 인신 매매를 공부 강력하고 인기있는 방법입니다. 기술의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상 2와 호환이 (가) 있습니다. 불행하게도, 비교적 최근까지,이 기술은 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 한 가지 큰 약점, 회절 제한 해결 방법 2, 고통했다. 최근, 형광 현미경의 측 방향 해상도 초해 형광 미시간의 도입으로 회절 장벽을 능가같은 PALM 3과 croscopy 기술. PALM의 측면 해상도는, 수십 나노 미터는 적으로 일반적으로 50 ~ 250 nm의 4 ~ 범위 치수가 소포의 연구에 적합합니다. 그것은 특정 세포 내 사이트에 자신의 인신 매매의 몇 가지 측면을 포함하여 소포의 이전에 액세스 할 수없는 특성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 ....
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프로토콜
1. 샘플 준비
- 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, DCVs을 대상으로 photoconvertible 또는 광활성 키메라를 코딩하는 DNA를 준비합니다.
참고 : 하나의 가능성은 DNA의 인코딩 조직 플라스 미노 겐 활성제-Dendra2 키메라 (TPA-Dendra2). Dendra2은 녹색에서 자외선 (12)에 노출시 적색 발광으로 전환 photoconvertible 단백질이다. - 고성능 # 1.5 커버의 문화 해마의 신경 세포는 표준 프로토콜 13 다음 ~ 5-10 일 동안 미끄러.
- 양이온 성 지질 시약을 사용하여 해마의 신경 세포를 개발하는 형질.
참고 : 바이러스 성 매개 감염이 성숙한 신경 세포에 대한 더 효과적입니다. 이러한 대안은 다른 곳에서 14 상세히 설명되었다.- ~ DNA 1 μg 최소 필수 배지 (MEM)와 양이온 성 지질 시약 4 μL, 250 μl를 함유하는 제 1.5 ㎖의 튜브 250 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브를 준비MEM의.
- 5 분 솔루션을 품어.
- 두 용액을 결합하고 추가로 30 분 동안 생성 된 혼합물을 배양한다.
- 배양시 배양 배지의 여러 ML을 포함....
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결과
도 1은 이미징 처리 한 최종 제품을 나타낸다. 본 PALM 콘텐츠에서 지역화 형광체의 가로 좌표를 중심 디스플레이 모드를 사용하여 도시하고, 연관된 DCV의 수퍼 - 해상도 화상을 가우시안 디스플레이 모드를 사용하여 도시된다.
그림 2A는 유사한 위드와 TPA-Dendra2을 표현 체외 해마 신경 세포에있는 여덟 일 소마와 인접 프로세스의 PALM의 이미지를 보여줍니다. 이미지의 중요한 기능은 종래와 PALM 이미지에서 puncta에 사이 (1) 유용한, 일대일 대응하고, 오버랩을 포함, PALM의 puncta에 (2) 상당히 작은 크기, 및 (3) 임시 해상도 여러 PALM의 puncta에에 단일 위드의 눈물 점.
그림 2B는 TPA-Dendra2을 표.......
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토론
PALM 및 관련 최고 해상도의 형광 현미경 기술은 최근 광학 현미경과 전자 현미경 (EM) 22 ~ 24의 잘 확립 된 형태의 귀중한 보완 등장했습니다. PALM의 긍정적 인 특성은 비교적 간단한 샘플 준비 최소한의 샘플 섭동 (perturbation)이 (가) 있습니다. 원칙적으로, PALM는 살아있는 세포를 연구 할 수있다. 아마 PALM의 주요 음의 속성은 크게 살아있는 세포에 빠르게 동적 프로세스의 연구를 방해 시간이 소요되는 데이터 수집이다. 또한, PALM은 비교적 새로운, 따라서 적절한 강력한 형광 및 샘플 준비를위한 데이터 수집 및 분석을위한 프로토콜은 완전히 개발 및 / 또는 3 문서화되어 있지 않습니다.
여기에서 우리는 고정, 배양 된 세포에있는 소포의 단일 색상, PALM 기반 연구에 적합 프로토콜을 설명했다. 프로토콜은 또한 유사의 개발을위한 좋은 출발점감독, 듀얼 컬러 PALM 연구. 우리의 프로토콜의 효능은 우.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은, (BAS에) 2 R15 GM061539-02을 부여 (JEL에) 2 R15 NS40425-03, MH 66179 (오레곤 보건 과학 대학 / OHSU 박사 게리 은행에)는 건강의 국립 연구소에 의해 지원하고, P30했다 NS061800 (OHSU의 박사 슈 아이 허에). 우리는 해마 신경 세포의 문화에 광범위한 지원을위한 바바라 Smoody 감사합니다, 박사 부부. 이 원고의 중요한 읽기 브라이언 긴 제임스 아브 네이.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자이스 팜 | 칼 자이스, Inc. | Zeiss 효율적인 내비게이션 (ZEN) 소프트웨어와 형광 필터 세트 77 HE GFP/mRFP/Alexa633이 포함된 | Elyra PS.1 |
| Lipofectamine 2000 형질주입 시약 | Life Technologies | 11668-019 | |
| 최소 필수 매체 | 생명 기술 | 11095-080 | |
| 인산염 완충 식염수 | 생명 기술 | 10010049 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 19208 | |
| 자당 | 시그마-알드리치 | S-8501 | |
| 성장 유리 커버 슬립 18mm 1.5D | 피셔 과학 | NC0059095 |
참고문헌
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).<....
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재인쇄 및 허가
