JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Immunhistokemiske og Calcium Imaging Methods in whole- mount rotteretina

Published: October 13, 2014
doi:
10.3791/51396
, , ,
1Department of Neurobiology,University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences,Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles

Summary

Immunhistokemi protokoller anvendt til at undersøge lokalisering af et specifikt protein i nethinden. Calcium billeddiagnostiske teknikker er ansat til at studere calcium dynamik i retina-ganglieceller og deres axoner.

Abstract

I denne artikel beskriver vi de redskaber, reagenser og de praktiske skridt, der er nødvendige for: 1) vellykket forberedelse af whole- mount nethinder for immunhistokemi og 2) calcium billeddannelse til undersøgelse af spænding gated calcium kanal (VGCC) medieret calcium signalering i retina ganglieceller. Calcium imaging metode beskriver vi omgår spørgsmål vedrørende ikke-specifik belastning af fordrevne amacrine celler i ganglion cellelag.

Introduction

Retina-ganglieceller (rGCS) udtrykker L-, N-, P / Q og T-typen VGCC som bestemt ved farmakologisk blokade af disse bestanddele af helcelle Ca kanalisere nuværende 1,2. VGCC er transmembrane multimere proteiner, der er involveret i transmitterfrigivelse, gentranskription, celle regulering og synaptisk plasticitet 3,4,5. Funktionelle VGCCs består af mindst tre særskilte klasser af underenheder: store, transmembrane α 1 poredannende underenheder, der etablerer kanalens biofysiske og farmakologiske egenskaber, primært ekstracellulære ekstra α 2 δ underenheder og intracellulære β underenheder. De to sidstnævnte formular heteromerkomplekser med forskellige α 1 underenheder og ændre gating kinetik og menneskehandel af kanalerne til plasmamembranen 6.

I de seneste årtier har mange teknikker blevet anvendt til at studere protein EXPREssion, såsom immunhistokemi, enzymkoblet immunosorbent-assay, western-analyse og flow-cytometri. Disse teknikker kræver anvendelse af specifikke antistoffer til påvisning af et givet protein af interesse og giver stærke værktøjer til lokalisering og fordeling af specifikke proteiner i forskellige væv. Teknikker, der anvendes til at påvise og kvantificere mRNA-ekspressionsniveauer af et bestemt protein, såsom Northern blot-analyse af RT-PCR, kvantitativ reel-tid RT-PCR, in situ-hybridisering, cDNA microarrays og ribonuklease beskyttelse assay tilvejebringe en alternativ fremgangsmåde, når antistoffer er ikke let til rådighed, eller hvis ekspressionsniveauer af et bestemt protein er lavt 7. Men en begrænsning i anvendelsen af ​​sådanne molekylære teknikker er den krævede identifikation af gensekvensen.

For at lokalisere proteiner i nethinden, kan immunhistokemi udføres på whole- mount nethinder. På grund af tilgængeligheden af ​​de rGCS, den whole- mountforberedelse giver en fremragende platform til at studere lokalisering af specifikke proteiner til RGC somata og deres axoner.

Ud over deres lokalisering kan visse funktionelle egenskaber VGCCs i rGCS påvises ved anvendelse af calcium billeddannende teknikker. Vi beskriver en calcium imaging protokol til selektivt at mærke rGCS med en calcium indikatorfarvestof til måling af intracellulær calcium dynamik. Bidraget af forskellige VGCCs til calcium signal i forskellige cellulære rum kan isoleres ved anvendelse af undertype-specifikke Ca-kanalblokkere.

Måske en af ​​de mest fordelagtige aspekter af calcium imaging her beskrevne teknik, er evnen til samtidigt og uafhængigt optage fra flere rGCS og deres axoner. Selvom mange fysiologiske teknikker, såsom hel celle patch clamp optagelse, giver høj tidslig optagelser Resolution af membranstrømme, det somatiske eller axonal kilde THESe strømme optaget, ikke kan diskrimineres og optagelser kan kun foretages fra en enkelt neuron ad gangen. Multielectrode arrays (MEA) er i stand til samtidigt at optage pigge fra mange celler, men kan hverken opdage eller diskriminere aktivering af for eksempel forskellige undertyper af calciumkanalerne. MEA fortrinsvis optage fra celler, der er placeret i umiddelbar nærhed af en given elektrode 8 og optage fra celler, der frembringer store pigge 9. Optiske billeddiagnostiske metoder giver en alternativ strategi, hvormed de samtidige og uafhængige optagelser af hele populationer af celler, der kan integreres med oplysningerne fra enkelt celle mikroelektrode og patch clamp optagelse og MEA optagelse. Selvom calcium billeddiagnostiske teknikker er beskrevet her var ansat til at studere calcium dynamik rGCS kan patch clamp og multilaterale miljøaftaler også anvendes parallelt med yderligere at belyse de ioniske strømme og standardtilsætningsforsøg egenskaber rGCS.

<pclass = "jove_content"> Da fordrevet amacrine celler udgør omkring 60% af den neuronale population i ganglion cellelag i mus nethinden 10, var vores mål at bruge en belastning teknik, der selektivt mærker rGCS med en syntetisk calcium indikatorfarvestof i en whole- mount præparat. Selv syntetiske calcium indikatorfarvestoffer giver en fremragende platform for studiet af intracellulære calcium dynamik, har den udbredte anvendelse blevet hæmmet af den manglende evne til effektivt at indlæse specifikke populationer af neuroner inden for et givet netværk. Mange teknikker såsom isætning 11 og elektroporation 8,12 er blevet udført for at indlæse hele populationer af celler imidlertid sådanne teknikker ikke diskriminerer mellem specifikke celletyper. Genetisk kodet calcium indikatorer giver evnen til selektivt at mærke specifikke populationer af celler imidlertid sådanne metoder kræver frembringelsen af transgene dyr 13. Vor teknik beskriver en method til selektivt at mærke rGCS i whole- mount forberedelse via synsnerven stub injektion af en calcium indikatorfarvestof.

Taget sammen, de strukturelle og fysiologiske teknikker beskrevet i denne artikel giver en platform for at studere lokalisering og bidrag VGCCs til calcium signal i rGCS og deres axoner.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for velfærd forsøgsdyr udstedt af US Public Health Service Politik om Human Care og brugen af ​​forsøgsdyr og udvalg Animal Forskning University of California-Los Angeles (UCLA). Mandlige og kvindelige voksne Sprague-Dawley rotter (Charles River Lab, Wilmington, MA) i alderen 3-5 uger blev anvendt. 1. Animalske og Tissue Forberedelse til whole- mount nethinden og Immunohistokemi protokol Forbered følgende ma…

Representative Results

Immunolabeling med specifikke antistoffer giver en platform for at studere lokaliseringen af ​​bestemte proteiner af interesse i nethinden og calcium imaging teknik tillader studiet af bidraget fra de VGCCs til calcium dynamik i de retinale ganglieceller og deres axoner. Ved anvendelse af et antistof mod ganglioncelle protein RBPMS (RNA-bindende protein med flere splejsning), som selektivt mærker rGCS 19, var vi i stand til at vise, at Fluo-4 mærkningen er begrænset til gan…

Discussion

I denne artikel har vi beskrevet to forskellige teknikker: 1) Immunohistokemi at vise Fluo-4 lokalisering til gangliecellerne i retinale wholemounts, og 2) Calcium billedbehandling til at analysere calcium dynamik i retina-ganglieceller og deres axoner.

Immunhistokemi under anvendelse wholemounts er blevet anvendt til at afsløre lokaliseringen af proteiner i gnaver nethinden 20-23. Der er dog nogle begrænsninger. Kvaliteten af ​​farvningen er stærkt afhængig af antistoffet…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. S. Stella og Helen Vuong for bidrag til calcium imaging-protokollen. Vi takker Dr. K. Ark til at filme interviewet scener. Vi takker Dr. Arlene Hirano for hendes kommentarer til manuskriptet. Denne forskning og udvikling projektet blev gennemført af forfatterne på David Geffen School of Medicine på UCLA og er gjort mulig ved en kontrakt aftale, der blev tildelt, og som administreres af US Army Medical Research & Materiel Kommando (USAMRMC) og Telemedicin & Advanced Technology Research Center (TATRC), ved Fort Detrick, MD under kontrakt Nummer: W81XWH-10-2-0077. Støtten til disse undersøgelser også kom fra NIH EY04067 og en VA Merit anmeldelse (NB). NCB er en VA Career Research Scientist.

Materials

Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000  Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Keywords: ImmunohistochemistryCalcium ImagingWholemount RetinaRetinal Ganglion CellsVoltage-gated Calcium ChannelsDisplaced Amacrine Cells
check_url/kr/51396?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image