Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina
Summary
Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.
Abstract
In dit artikel beschrijven we de instrumenten, reagentia, en de praktische stappen die nodig zijn voor: 1) succesvol bereiding van wholemount netvliezen voor immunohistochemie en 2) calcium imaging voor de studie van spanningsgevoelige calciumkanalen (VACK) gemedieerde calcium signalering in retinale ganglioncellen. De calcium imaging methode beschrijven we omzeilt kwesties met betrekking tot niet-specifieke belasting van ontheemd amacrine cellen in het ganglion cellaag.
Introduction
Retinale ganglioncellen (RGC's) tot expressie L, N, P / Q en T-type VGCC bepaald door farmacologische blokkade van deze onderdelen van de gehele cel Ca kanaalstroom 1,2. VGCC zijn transmembraan multimerische eiwitten die betrokken zijn bij de zender release, gen-transcriptie, cel regulatie en synaptische plasticiteit 3,4,5. Functionele VGCCs bestaan uit ten minste drie onderscheiden subeenheden: grote, α 1 transmembraan porie vormende subeenheden die biofysische en farmacologische eigenschappen van het kanaal, voornamelijk extracellulair hulpstoffen α 2 δ subeenheden en intracellulaire β subeenheden vastgesteld. De laatste twee vormen heteromere complexen met verschillende α 1 subeenheden en verandert de kinetische eigenschappen van en handel van de kanalen naar de plasmamembraan 6.
In de afgelopen decennia zijn vele technieken zijn gebruikt om eiwit expre studerensie, zoals immunohistochemie, enzymgekoppelde immunosorbent assay, western analyse en flowcytometrie. Deze technieken vereisen het gebruik van specifieke antilichamen voor de detectie van een bepaald eiwit van interesse en bieden krachtige gereedschappen voor de lokalisatie en verdeling van specifieke eiwitten in verschillende weefsels. Technieken voor mRNA expressieniveaus van een bepaald eiwit detecteren en kwantificeren zoals Northern-blot-analyse, RT-PCR, real-time kwantitatieve RT-PCR, in situ hybridisatie, cDNA microarrays en bescherming ribonuclease assay een alternatieve benadering als antilichamen niet gemakkelijk beschikbaar zijn of expressie van een bepaald eiwit laag 7. Echter, een beperking van het gebruik van dergelijke moleculaire technieken is de vereiste identificatie van de gensequentie.
Om eiwitten in het netvlies lokaliseren, immunohistochemie kan worden uitgevoerd op wholemount netvlies. Door de toegankelijkheid van de RGC de wholemountvoorbereiding biedt een uitstekend platform om de lokalisatie van specifieke eiwitten te bestuderen om het RGC somata en hun axonen.
Naast hun lokalisatie, kunnen enkele functionele eigenschappen van de VGCCs in RGC worden aangetoond door het gebruik van calcium beeldvormingstechnieken. We beschrijven een calcium imaging protocol selectief labelen RGC met een calcium indicator kleurstof intracellulaire calcium dynamiek meten. De bijdrage van de verschillende VGCCs de calcium signaal in verschillende cellulaire compartimenten kunnen worden geïsoleerd met gebruik van subtype-specifieke Ca-antagonisten.
Misschien is een van de meest voordelige aspecten van de calcium beeldvormende techniek die hier beschreven is het vermogen om gelijktijdig en onafhankelijk opnemen van meerdere RGC en hun axonen. Hoewel veel fysiologische technieken, zoals whole cell patch clamp opname, een hoge tijdsresolutie opnames membraan stromen, somatische of axonale bron van these stromen opgenomen kunnen niet worden onderscheiden en opnamen kunnen alleen worden gemaakt uit een neuron tegelijk. Multielectrode (MEA) kunnen gelijktijdig opnemen pieken van vele cellen, maar kan niet detecteren of discrimineren de activatie van, bijvoorbeeld, verschillende subtypen van calciumkanalen. Meas voorkeur opnemen van cellen die zich bevinden in de nabijheid van een bepaalde elektrode 8 en opnemen van cellen die grote spikes 9 genereren. Optical imaging methoden geven een alternatieve strategie voor de gelijktijdige en onafhankelijke opnamen van hele populaties van cellen die kunnen worden geïntegreerd met de resultaten van eencellige micro-elektrode en patch clamp opname en MEA opname informatie mogelijk. Hoewel calcium beeldvormingstechnieken hier beschreven werden gebruikt om de calciumdynamiek RGC bestuderen, kunnen patch clamp en MEA worden gebruikt parallel aan de opheldering van de ionische stromen en additie eigenschappen van RGC.
<pclass = "jove_content"> Sinds ontheemd amacrine cellen maken ongeveer 60% van de neuronale populatie in het ganglion cellaag in de muis netvlies 10, ons doel was om een laad-techniek die selectief etiketten RGC met een synthetische calcium indicator kleurstof in een gebruiken wholemount bereiding. Hoewel synthetische calcium indicator kleurstoffen uitstekend platform voor de studie van intracellulaire calcium dynamiek heeft het wijdverbreide gebruik belemmerd door het onvermogen om effectief ladingsspecifiek populaties van neuronen in een bepaald netwerk. Veel technieken zoals bulkbelading 11 en elektroporatie 8,12 uitgevoerd laden gehele celpopulaties zijn dergelijke technieken geen onderscheid tussen specifieke celtypen. Genetisch gecodeerde calcium indicatoren de mogelijkheid om specifieke celpopulaties selectief labelen, maar dergelijke werkwijzen vereisen het genereren van transgene dieren 13. De techniek beschrijft een method om selectief labelen RGC in de wholemount voorbereiding via oogzenuw stomp injectie van een calcium indicator kleurstof.Samen genomen, de structurele en fysiologische technieken die in dit artikel geven een platform om de lokalisatie en de bijdrage van de VGCCs om de calcium signaal in RGC en hun axonen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
1) Immunohistochemistry tot Fluo-4 lokalisatie naar het ganglion cellen in het netvlies wholemounts tonen, en 2) Calcium beeldvorming aan calcium dynamiek analyseren in retinale ganglioncellen en hun axonen: In dit artikel hebben we twee verschillende technieken beschreven.
Immunohistochemie met wholemounts is gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de retina knaagdier 20-23 onthullen. Er zijn echter een aantal beperkingen. De kwaliteit van de kleuring is sterk afhankelijk van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr S. Stella en Helen Vuong voor bijdragen aan het calcium imaging protocol. Wij danken Dr K. Sheets voor het filmen van het interview scènes. Wij danken Dr Arlene Hirano voor haar commentaar op het manuscript. Dit onderzoek en ontwikkeling project werd uitgevoerd door de auteurs aan de David Geffen School of Medicine aan de UCLA en wordt mogelijk gemaakt door een overeenkomst van opdracht die werd toegekend en beheerd door de US Army Medical Research en Materieel Command (USAMRMC) en de Telemedicine & Advanced Technology Research Center (TATRC), in Fort Detrick, MD onder Contract Number: W81XWH-10-2-0077. Ondersteuningsmaatregelen voor deze studies kwam ook uit NIH EY04067 en een VA Merit Beoordeling (NB). NCB is een VA Career Research Scientist.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
References
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
- Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
- Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
- Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
- Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
- Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
- Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
- Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
- Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
- Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
- Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
- Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
- Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
- Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
- Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
- Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
- Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
- Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
- Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
- Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
- Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
- Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
- Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
