Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het afgelopen decennium in de richting van de identificatie en karakterisering van enzymen die betrokken zijn bij de synthese (diguanylate cyclases) en afbraak (fosfodiesterasen) van de tweede boodschapper c-di-GMP. Daarentegen weinig informatie beschikbaar is over de moleculaire mechanismen en cellulaire componenten waardoor deze signalering molecuul regelt een breed scala van cellulaire processen. De meeste van de bekende effector-eiwitten behoren tot de familie Pilz of zijn gedegenereerd diguanylate cyclases of fosfodiesterases die op katalyse hebben gegeven en effector functie hebben aangenomen. Dus, om beter de cellulaire c-di-GMP netwerk definiëren diverse bacteriën experimentele vereist om nieuwe effectoren die betrouwbaar silico voorspellingen niet identificeren en te valideren.
We hebben onlangs een nieuwe Capture Compound massaspectrometrie (CCMS) gebaseerde technologie als een krachtig instrument om ontwikkeldbiochemisch identificeren en karakteriseren van c-di-GMP-bindende eiwitten. Deze techniek is eerder gerapporteerd voor diverse organismen 1 is. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het protocol dat we gebruiken om dergelijke signaleringscomponenten sonde. Als voorbeeld, gebruiken we Pseudomonas aeruginosa, een opportunistisch pathogeen, waarbij c-di-GMP speelt een cruciale rol in virulentie en biofilm controle. CCMS geïdentificeerd 74% (38/51) van de bekende of voorspelde elementen van de C-di-GMP netwerk. Deze studie legt de CCMS procedure in detail, en stelt het als een krachtige en veelzijdige tool om nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.
Introduction
c-di-GMP is een belangrijke tweede messenger gebruikt door de meeste bacteriën diverse aspecten van hun groei en gedrag beheersen. Bijvoorbeeld, c-di-GMP reguleert celcyclus, motiliteit en de expressie van exopolysacchariden en oppervlak adhesinen 2-4. Door de coördinatie van dergelijke werkwijzen c-di-GMP bevordert biofilmvorming, een proces dat is geassocieerd met chronische infecties van verschillende pathogene bacteriën 5. c-di-GMP wordt gesynthetiseerd door enzymen genaamd diguanylate cyclases (DGCs) dat een katalytische GGDEF domein 4 haven. Sommige DGCs bezitten een remmende site die naar beneden regelt de cyclase activiteit op c-di-GMP bindend. De afbraak van c-di-GMP wordt gekatalyseerd door twee verschillende klassen van fosfodiësterases (PDE) herbergen ofwel een katalytische EAL of HD-GYP domein 6,7.
De meeste bekende effector eiwitten die direct binden c-di-GMP behoren tot één van drie klassen van eiwitten: katalytischebondgenoot inactief GGDEF of EAL domeinen en Pilz domeinen, kleine moleculaire schakelaars die vormveranderingen op c-di-GMP bindend 8 ondergaan. DGCs, PDE's en Pilz eiwitten zijn goed gekarakteriseerd en hun domeinen kunnen worden voorspeld in silico relatief veilig. Een bijzonder belang is nu gericht op de identificatie van nieuwe klassen van c-di-GMP effectoren. Sommige c-di-GMP effectoren met verschillende bindingsmotieven werden onlangs zoals beschreven als de CRP / Achterwaarts- eiwit familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia of de transcriptionele regulator FleQ in P. aeruginosa 9,10. Bovendien werden c-di-GMP-specifieke riboswitches recent geïdentificeerd en naar genexpressie in een C-di-GMP-afhankelijke wijze 11. De c-di-GMP binding motieven van verschillende effectoren worden alleen slecht geconserveerd maken bioinformatic voorspellingen van dergelijke eiwitten moeilijk. Om dit probleem, een biochemische werkwijze, die is gebaseerd op het gebruik van een c-di-GMP spe ontwikkelden wefieke Capture Compound in combinatie met massaspectrometrie 1,12,13.
We hebben onlangs een nieuw ontworpen driewaardig c-di-GMP invangverbinding (CDG-CC figuur 1) 1. Deze chemische steiger bestaat uit: 1) een C-di-GMP eenheid gebruikt als aas voor c-di-GMP vangen bindende eiwitten, 2) een UV-licht activeerbare reactieve groep gebruikt verknopen de CDG-CC de gebonden eiwitten en 3) een biotine aan de gevangen eiwitten met streptavidine beklede magnetische korrels isoleren. De CDG-CC kan worden gebruikt om direct en specifiek vangen c-di-GMP effectoren van complex mengsel van macromoleculen zoals cellysaten. Invangverbinding gebaseerde chemische proteomics benaderingen zijn eerder gerapporteerd toepasbaar is op een groot aantal organismen, bijvoorbeeld Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium en P. aeruginosa 1,14.
In deze methodologische paper,Wij bieden een diepgaande beschrijving van het CCMS procedure met behulp van extracten van P. aeruginosa als voorbeeld. Deze studie stelt CCMS als een krachtige en veelzijdige tool om biochemisch nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Speciale aandacht moet worden genomen op verschillende stappen van het protocol. De eiwitconcentratie is een kritische parameter met een concentratie van 10 mg / ml moeilijk te bereiken wanneer de cellen worden gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijvoorbeeld biofilms of kleine kolonie varianten). Aldus zullen pellet resuspensie worden uitgevoerd in een klein volume lysisbuffer. Proteïne concentraties worden verlaagd tot 8 mg / ml. Vergeleken met de werkwijze gepubliceerd door Nesper et al.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
