캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
상당한 진전은 제 메신저 C 디 GMP의 합성 (diguanylate cyclases) 열화 (포스 포)에 관여하는 효소의 확인 및 특성화를 향해 지난 10 년 동안 만들어졌다. 대조적으로, 약간의 정보가이 시그널링 분자가 세포 과정의 다양한 범위를 조절하는 분자 메커니즘을 통해 세포 성분과 관련하여 가능하다. 알려진 이펙터 단백질의 대부분은 필츠 (Pilz) 가족에 속한다 또는 촉매를 포기하고 이펙터 기능을 채택했다 diguanylate cyclases 또는 포스 포 디에스 퇴화된다. 따라서, 더 나은 실험 방법은 실리코 예측의 신뢰성이 실패하는 신규 이펙터를 식별하고 검증하는 데 필요한 박테리아 광범위 셀룰러 C 디 GMP 네트워크를 정의한다.
우리는 최근에 강력한 도구로 새로운 캡처 복합 질량 분석 (CCMS) 기반 기술을 개발했다생화학 적 식별 및 C 디 GMP 결합 단백질을 특성화. 이 기법은 이전에 하나의 유기체에 적용 가능한 다양한 것으로보고되었다. 여기서 우리는 이러한 신호 성분을 프로빙 이용하는 프로토콜의 자세한 설명을 제공한다. 예로서, 우리는 녹농균, C 디 GMP는 병독성 및 생물막 제어에 중요한 역할을하는 기회 적 병원균 사용. CCMS는 C 디 GMP 네트워크의 공지되거나 예측 된 성분의 74 % (51분의 38)를 식별. 본 연구는 상세히 CCMS 절차를 설명하고, 소분자 시그널링에 관련된 신규 한 구성 요소를 식별하기위한 강력하고 다양한 도구로 정한다.
Introduction
C 디 GMP 그들의 성장 및 행동의 다양한 측면을 제어하기 위해 사용되는 대부분의 세균에 의해 두번째 키 메신저. 예를 들어, C-디 GMP는 세포주기 진행, 운동성 및 엑소 폴리 사카 라이드 및 표면 adhesins 2-4의 발현을 조절한다. 이러한 프로세스의 조정을 통해 C 디 GMP는 biofilm 형성, 병원성 박테리아 5의 범위의 만성 감염과 관련된 프로세스를 촉진합니다. C 디 GMP는 촉매 GGDEF 도메인 4 항구 diguanylate cyclases (DGCs)라는 효소에 의해 synthetized된다. 일부 DGCs 다운 C-GMP 디 바인딩시 클라 제 활성을 조절하는 사이트 억제을 갖는다. C 디 GMP의 분해는 촉매 EAL 또는 HD-GYP 중 도메인 6,7 숨겨 포스 포의 두 가지 클래스 (PDE는)에 의해 촉매된다.
직접 C 디 GMP 결합 공지 효과기 단백질의 대부분은 단백질의 세 개의 클래스 중 하나에 속한다 : 촉매를동맹 비활성 GGDEF 또는 EAL 도메인과 필츠 (Pilz) 도메인, C 디 GMP 8 바인딩에 따라 구조 변화를 받아야 작은 분자 스위치. DGCs, PDE는 필츠 단백질은 잘 특징과 도메인은 상대적으로 안전하게 실리에 예측할 수있다. 특히 관심은 이제 C 디 GMP 이펙터의 새로운 클래스의 식별에 초점을 맞추고 있습니다. 다른 바인딩 모티브 일부 C 디 GMP 이펙터는 부르크 홀데 리아 cenocepacia에서 CRP / FNR 단백질 가족 Bcam1349 또는 P.의 전사 조절 FleQ로 최근에 이러한 설명했다 녹농균 (9, 10). 또한, C-GMP 디 특정 리보 스위치 최근 식별과 C 디 GMP 의존적 11 유전자 발현을 제어하는 것으로 나타났다. 다른 이펙터의 C 디 GMP 바인딩 모티브는 제대로 보존 된 단백질의 생물 정보 학적 예측을 어렵게하고있다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 C 디 GMP의 SPE의 사용에 기초 생화학 방법을 개발cific 캡처 화합물은 질량 분석 1,12,13과 함께.
우리는 최근 (CDG-CC, 그림 1) 새로운 가의 C 디 GMP 캡처 화합물을 설계 한 일. 이 화학 골격이 구성된다 결합 단백질 C 디 GMP를 캡처 미끼로 이용 1) C 디 GMP 잔기, 2) UV-광활성 반응성 기는 링크 크로스를 사용 결합 단백질 CDG-CC 및 3) 비오틴 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 자성 비드를 이용하여 캡쳐 된 단백질을 분리. CDG-CC 직접 구체적 세포 용 해물과 같은 거대 분자의 복합체 C로부터 디 GMP 이펙터를 캡쳐 할 수있다. 캡처 계 화합물 및 화학 프로테오믹스 기반 방식은 이전 생물 광범위한 적용 것으로보고 된 예 Caulobacter crescentus, 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리엄 및 P. aeruginosa의 1,14.
이 방법론 논문에서,우리는 P. 추출물을 사용 CCMS 절차의 깊이 설명에 제공 예를 들어 녹농균. 이 연구는 생화학 적으로 작은 분자 신호 전달에 관여하는 새로운 구성 요소를 식별 할 수있는 강력하고 다양한 도구로 CCMS를 설정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
특별한주의가 프로토콜의 여러 단계에서주의해야한다. 단백질 농도가 10 ㎎의 농도를 갖는 중요한 파라미터이다 / ml의 세포가 특정한 성장 조건 (예를 들면 작은 콜로니 생물막 또는 변이체) 하에서 성장 될 때 도달하기 힘들어. 따라서, 펠릿 부유 용균 완충액 저용량에서 수행되어야한다. 단백질 농도는 8 ㎎ / ㎖로 감소 될 수있다. Nesper 외. (1)에 의해 게시 된 방법과 비교하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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