Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Um progresso considerável foi feito durante a última década para a identificação e caracterização de enzimas envolvidas na síntese (ciclases diguanylate) e degradação (fosfodiesterase) do segundo mensageiro c-di-GMP. Em contraste, há pouca informação disponível sobre os mecanismos moleculares e componentes celulares através do qual essa molécula de sinalização regula uma gama diversificada de processos celulares. A maioria das proteínas efetoras conhecidos pertencem à família Pilz ou estão degenerados ciclases diguanylate ou phosphodiesterases que desistiram de catálise e adotaram a função efetora. Assim, para definir melhor a rede c-di-GMP celular numa vasta gama de bactérias, métodos experimentais são necessários para identificar e validar novos efectores para os quais fiável em predições silico falham.
Recentemente, desenvolvemos um romance Captura Espectrometria de Massa Compound (CCMS) de base tecnológica como uma ferramenta poderosa paraidentificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP. Esta técnica tem sido relatada previamente para ser aplicável a uma vasta gama de organismos 1. Aqui nós damos uma descrição detalhada do protocolo que nós utilizamos para investigar tais componentes de sinalização. Como um exemplo, usamos a Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico oportunista, em que c-di-GMP desempenha um papel crítico no controle de biofilme e virulência. CCMS identificados 74% (38/51) dos componentes conhecidos ou previstos da rede c-di-GMP. Este estudo explica o procedimento CCMS em detalhe, e estabelece-lo como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar novos componentes envolvidos na pequena molécula de sinalização.
Introduction
c-di-GMP é um segundo mensageiro chave utilizados pela maioria das bactérias para controlar vários aspectos do seu crescimento e comportamento. Por exemplo, c-di-GMP regula a progressão do ciclo celular, motilidade e a expressão de exopolissacáridos e adesinas de superfície 2-4. Através da coordenação de tais processos c-di-GMP promove a formação de biofilme, um processo que está associado com infecções crónicas de uma variedade de bactérias patogénicas 5. c-di-GMP é sintetizado por enzimas chamadas ciclases diguanylate (PED) que abrigam um domínio GGDEF catalítico 4. Alguns PED possuem um site de inibidor que regula a atividade para baixo ciclase após ligação c-di-GMP. A degradação da proteína c-di-GMP é catalisada por duas classes distintas de fosfodiesterases (PDEs) ou albergando um EAL catalítica ou HD-GYP domínio 6,7.
A maioria das proteínas efectoras conhecidos que se ligam directamente c-di-GMP pertencem a uma das três classes de proteínas: catalíticaGGDEF ou EAL domínios aliado inativos e domínios Pilz, pequenos interruptores moleculares que passam por mudanças de conformação após ligação c-di-GMP 8. PEDs, Pilz PDEs e proteínas estão bem caracterizados e os seus domínios pode ser prevista em silício de forma relativamente segura. Um interesse particular agora está focado na identificação de novas classes de efetores c-di-GMP. Alguns efetores c-di-GMP com diferentes motivos de ligação foram descritos recentemente, como o CRP / FNR Bcam1349 família de proteínas em Burkholderia cenocepacia ou o FleQ regulador de transcrição em P. aeruginosa 9,10. Além disso, riboswitches específico GMP-c-di foram recentemente identificados e mostrado para controlar a expressão de genes de uma forma c-di-GMP-dependente 11. Os motivos c-di-GMP ligação dos diferentes efetores são apenas mal conservada fazer previsões de bioinformática de tais proteínas difícil. Para resolver este problema, foi desenvolvido um método bioquímico, o qual se baseia na utilização de uma spe c-di-GMPCaptura espe- Composto combinada com a espectrometria de massa 1,12,13.
Nós projetamos recentemente um romance trivalente c-di-GMP Captura Composto (CDG-CC, Figura 1) 1. Este andaime química é composta por: 1) um radical de c-di-GMP utilizado como isca para capturar c-di-GMP proteínas de ligação, 2) um grupo reactivo UV-fotoactivável usadas para reticular o CDG-CC para as proteínas ligadas e 3) uma biotina para isolar as proteínas capturadas usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. O CDG-CC podem ser usadas para capturar directamente e especificamente efectores c-di-GMP partir de uma mistura complexa de macromoléculas como lisados celulares. Composto de captura com base e abordagens químicas proteómica à base ter sido previamente relatado para ser aplicável a uma vasta gama de organismos, por exemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella typhimurium enterica serovar e P. aeruginosa 1,14.
Neste trabalho metodológico,nós fornecemos uma descrição em profundidade do procedimento CCMS utilizando extratos de P. aeruginosa como um exemplo. Este estudo estabelece CCMS como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar bioquimicamente novos componentes envolvidos na sinalização molécula pequena.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um cuidado especial deve ser tomado em vários passos do protocolo. A concentração de proteína é um parâmetro crítico com uma concentração de 10 mg / ml de ser difícil de alcançar quando as células são cultivadas sob condições específicas de crescimento (por exemplo, biofilmes ou pequenas variantes de colónias). Assim, a re-suspensão da pelota deve ser realizada num pequeno volume de tampão de lise. As concentrações de proteína pode ser diminuída para 8 mg / ml. Comparado com o método pub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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