Одноместный ген клеток выражение анализ необходим для понимания стволовых клеток неоднородности.
Неоднородность популяции стволовых клеток затрудняет детальное понимание биологии стволовых клеток, таких, как их дифференциации склонности к различных линий. Одна ячейка транскриптома анализ может быть новый подход к рассекает индивидуальные различия. Мы разработали метод Single Cell Qrt-PCR, и подтвердил, что этот метод хорошо работает в нескольких профилей экспрессии генов. В уровне одной клетки, каждый человек эмбриональных стволовых клеток, отсортировано по OCT4 :: EGFP-положительные клетки, обладает высокой выражение в OCT4, но другой уровень экспрессии NANOG. Наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезным, чтобы допросить неоднородности населения.
Самые высокие популяции эукариот являются гетерогенными, таким образом, с анализом объединенной популяции, часто бывает трудно интерпретировать их клеточных функций. Отдельные клетки внутри популяции может быть немного отличается, и эти различия могут иметь важные последствия для свойства и функции всего населения 1, 2. Тем более, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), как известно, неоднородны, что вызывает различные уровни плюрипотентности и разнообразные потенциалы в спецификации клонов в деликатно отличительных способов 3, 4. Например, различные антигенов клеточной поверхности могут быть использованы для категоризации недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, 5 и группа Austin Smith предложены различные уровни в плюрипотентности мышиных эмбриональных стволовых клеток, в зависимости от их морфологии, дифференцировки склонности и зависимости от пути передачи сигналов 6. Это явление было предположение, в человеческом эмбрионеNIC стволовые клетки 7. В то время как были выполнены исследования общей среди различных линий стволовых клеток, а не отдельные единичные стволовых клеток, это может быть очень интригующим для анализа различных уровней плюрипотентности на уровне одной клетки, которые потенциально влияет на их дифференциации возможностей в направлении всех соматических клеточных клонов.
Клеточная и молекулярная гетерогенность может быть продиктовано транскрипции профилирования, которая называется «единого транскриптома клеток" и подчеркивает, новые подходы к количественной уровни экспрессии гена 8-10. Для анализа уровня экспрессии гена в отдельных клетках, мы разработали простой, но надежный протокол одного клеток количественного RT-PCR. Мы подтвердили эффективность и целесообразность нашего протокола путем сравнения каждую половину отдельных клеточных лизатов, а также серийно разбавленных тотальную РНК из ЭСК, в результате чего минимальных технических изменений и различий. Кроме того, мы использовали генетический репортер линию, чтобы изолировать однородной рopulation из ЭСК, использующих систему таргетинга генов. Вектор донором для ориентации OCT4 локус (OCT4-2A-EGFP-ПГК-Puro построить) и пару Talen плазмид были использованы 11. Вектор доноров и пара Talen плазмид были введены в ЭСК (Н9, WA09) с помощью нашего nucleofection и клональную протокол выбора и поддержания ЭСК была выполнена на основе нашей повседневной протокола 12. Мы подтвердили этот генетический репортер линия выразить EGFP для выражения OCT4 в OCT4 :: EGFP ЭСК.
Наш результат показывает, что отдельные ЭСК (Начиная с OCT4 :: EGFP сильно положительные клетки) занимают высокие уровни экспрессии OCT4, но разные уровни экспрессии NANOG. Итак, наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезен для изучения населения неоднородностей плюрипотентных стволовых клеток.
Одноместный ген клеток профилирование может быть основным инструментом для прогнозирования функциональность одной клетки или все население. Из-за технических ограничений, весь анализ гена профилирование было ограничено средних населенных пунктов. Вариации паттернов экспрессии ген…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).
96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |