薄层色谱（TLC）分离和植物提取物的生物测定识别抗菌化合物
Summary
方法描述为薄层色谱（TLC）分离植物提取物和生物自显影接触，以确定抗菌代谢产物。该方法适用于红三叶草酚类化合物抑制超氨生产菌（HAB），原产于牛瘤胃的筛选。
Abstract
对植物的抗微生物化合物的常用屏幕包括由纸或薄层色谱法（PC或TLC）分离的植物提取物，露出色谱微生物悬浮液（ 例如，在液体培养基真菌或细菌或琼脂），允许时间为微生物生长中的潮湿环境中，并且可视区与无微生物生长。该筛选方法，被称为生物自显影的效果，取决于色谱分离的质量和用微生物培养条件下所采取的照顾。本文介绍了一种新型的应用氨基酸发酵菌的TLC和接触生物自显影技术的标准协议。将提取物上分离柔性（铝背）硅胶TLC板，并频带下的紫外线（UV）光可视化。区域被切出并孵育面朝下于琼脂接种试验微生物。抑制带被染色的琼脂平板可视化s的四氮唑红。该方法适用于红三叶草（ 红三叶品种。Kenland）分离酚类化合物及其筛查对梭状芽孢杆菌sticklandii，一个超氨产生菌（HAB）是原产于牛瘤胃活动。在TLC的方法适用于许多类型的植物提取物和其它的细菌菌种（好氧或厌氧），以及真菌的，可以作为测试生物体，如果培养条件进行修改，以适应植物的生长要求。
Introduction
在植物中测定抗微生物化合物需要分离的植物提取物的组分，露出试验微生物的那些部件，并确定由任何所述化合物的微生物的生长是否受到抑制。分离由纸或薄层色谱法（PC或TLC）是方便的，因为很多化合物可在平面表面上进行分离。分离是基于极性，与一些化合物的结合紧密的吸附剂（纤维素在PC机的情况下，以及各种在薄层的情况下，吸附剂）和迁移小于其他1， 图1提供的相对位置的一个例子在硅胶TLC板上分离后极性和非极性的酚类化合物。
图1。示出在硅胶薄层色谱（TLC）板分离后不同极性的化合物的分布。红三叶草（ 红三叶 L.）的酚类化合物被用作一个例子。极性化合物，如clovamide，有一种极性吸附剂像二氧化硅有很强的亲和力，并保持靠近原点（OR），而极性较小的化合物，如靠近溶剂前沿的3异黄酮（SF），分区更容易进入溶剂（除非水，酸，碱或包含它们比二氧化硅极性较小）和迁移更远了板。
的提取物在TLC板上分离后，试验微生物可以暴露于板上的所有化合物中，从而加速的提取物2的活性成分的鉴定。如果是真菌或细菌培养物暴露于色谱，会发生微生物生长无处不在，除了以上与生长抑制剂领域Ÿ化合物。抑制区则可以通过观察菌丝生长和生长无区域之间的对比，如果真菌已经应用3或者通过与该改变颜色由活细胞4降低或水解时的化合物喷雾可视化。虽然使用纸或薄层色谱的抗菌试验首先被施加到抗生素5和杀菌剂3,6，植物提取物，现在经常筛选出抗微生物化合物用这种方法，通常被称为生物自显影。本文中所描述的协议适用于薄层色谱生物自显影。 TLC被广泛使用，因为它是相对快速的，并且可以在不同的吸附剂（ 如硅胶，淀粉，氧化铝），以及提供良好的分辨率和灵敏度1进行。
植物提取物可用于TLC以多种方式来制备。常用的方法包括提取植物材料的ALCohol -水的混合物，如80％乙醇7,8，可能与另外的酸或碱9。以下在这些溶剂，其中含有一些水，并且可能是酸性或碱性的提取，提取物，必须进行浓缩，以便它们可以应用到TLC板在最小的体积。的醇-水提取物中的浓度可以通过与水不混溶的有机溶剂的8或与此类溶剂，如乙酸乙酯-乙醚（1:1，V / V）10,11的混合物隔开来实现。异植物代谢产物提取到不同的有机溶剂，这取决于它们的极性。以确保植物有机的酸或碱都在此阶段萃取到有机溶剂中，醇 – 水提取物的pH可以升高或降低与水溶性酸或碱解离的分析物转化为它们的nondissociated的形式，然后将它们溶于中性有机溶剂9。然后将有机相可以通过电子邮件在减压或在氮气氛下vaporated并调整为薄层所需的音量。该提取物的pH不太可能是致命的，因为分析物的分割成中性溶剂，小终体积，并在TLC板上分离前的提取物蒸发生物测定微生物。
这两种真菌和细菌被用作试验的微生物在植物生物自显影提取2。一些真菌，如黑星病的孢子发芽在TLC板（除了与抑制性化合物的区域），如果在一个营养液喷洒到板并孵育在潮湿的环境中几天3。 C.暗菌丝体星病的noninhibitory区提供了一个鲜明的对比，免费菌丝生长的区域。虽然细菌已被施加到薄层色谱（TLC）板以相同的方式4,12，细菌也被倾倒在TLC板面在琼脂覆盖13,14。酵母，如白色念珠菌 ，可在琼脂覆盖层被应用，以及14。此外，TLC板可以向下放置脸上琼脂上接种细菌10,15或酵母8，称为接触性生物自显影2的方法。
我们描述了一种接触生物自显影筛选抗菌酚类化合物从红三叶草（ 红三叶品种。Kenland）。该测试微生物是梭菌sticklandii，一个超瘤胃氨产生菌（HAB）和专性厌氧菌。尽管所使用的分离不能解决提取物的所有组成部分，它们有助于确定抗菌活性的区域，从而缩小可能的抗菌化合物的游泳池。该协议采用标准程序TLC 1。该协议还介绍了一些需要培养obli技术门厌氧菌对这样的测定，接触生物自显影15和可视化方法的具有四唑鎓盐，其染色活细胞2,4的 使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这个协议描述了一种用于提取物中分离到的化合物的子集，并通过接触生物自显影法测定的那些子集的简单方法。该方法非常类似于1使用Chomnawang 等人 15来筛选植物代谢产物抑制到淋病的细菌。生物自显影来屏幕抗菌植物化合物的类型取决于许多因素，包括微生物检验，实验室的设置，而该人（次）进行生物测定的喜好。联系生物自显影，在这项研究中所使用的方法，已经被批评?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢已故的博士。规范泰勒，系植物与土壤科学在肯塔基大学，允许我们使用的样品从他的红三叶草地块为这项研究。该项目是由农业部美国农业部。
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
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