पतली परत chromatographic (टीएलसी) विभाजन और संयंत्र निष्कर्षों की bioassays रोगाणुरोधी यौगिकों की पहचान करने के लिए
Summary
तरीके पौधों के अर्क की पतली परत chromatographic (टीएलसी) जुदाई और जीवाणुरोधी मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए संपर्क bioautography के लिए वर्णित हैं. तरीकों गोजातीय रूमेण का निवासी हाइपर अमोनिया उत्पादन बैक्टीरिया (HAB) बाधा लाल तिपतिया घास phenolic यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू कर रहे हैं.
Abstract
संयंत्र रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए एक सामान्य स्क्रीन (जैसे कवक या बैक्टीरिया शोरबा में या अगर), रोगाणुओं के लिए समय में विकसित करने की अनुमति माइक्रोबियल निलंबन को chromatograms उजागर, कागज या पतली परत क्रोमैटोग्राफी (पीसी या टीएलसी) द्वारा पौधों के अर्क को अलग करने के होते हैं एक आर्द्र वातावरण, और कोई माइक्रोबियल विकास के साथ क्षेत्रों visualizing. bioautography के रूप में जाना जाता है इस स्क्रीनिंग विधि की प्रभावशीलता, chromatographic जुदाई की गुणवत्ता और माइक्रोबियल संस्कृति शर्तों के साथ ध्यान रखा दोनों पर निर्भर करता है. इस पत्र एसिड fermenting बैक्टीरिया एमिनो एक उपन्यास आवेदन के साथ टीएलसी और संपर्क bioautography के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. निकालने लचीला (एल्यूमीनियम समर्थित) सिलिका टीएलसी प्लेटों पर अलग है, और बैंड पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत कल्पना कर रहे हैं. जोन परीक्षण सूक्ष्मजीव साथ inoculated अगर पर बाहर कटौती और चेहरा नीचे incubated हैं. निरोधात्मक बैंड अगर प्लेट धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे हैंएस के साथ tetrazolium लाल. विधि लाल तिपतिया घास की जुदाई (Trifolium pratense CV. Kenland) phenolic यौगिकों और क्लोस्ट्रीडियम sticklandii, गोजातीय रूमेण का निवासी है कि एक अति अमोनिया उत्पादन जीवाणु (HAB) के खिलाफ गतिविधि के लिए उनकी स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जाता है. टीएलसी तरीकों (एरोबिक या anaerobic), साथ ही कवक पौधों के अर्क और अन्य प्रजातियों के जीवाणु के कई प्रकार के लिए लागू संस्कृति शर्तों प्रजातियों के विकास की आवश्यकताओं को फिट करने के लिए संशोधित कर रहे हैं, परीक्षण जीवों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
पौधों में रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए परख, एक संयंत्र निकालने के घटकों को अलग करने के लिए उन घटकों के लिए एक परीक्षण सूक्ष्मजीव उजागर, और सूक्ष्मजीव के विकास यौगिकों में से किसी से हिचकते है निर्धारित करने की आवश्यकता है. कई यौगिकों एक planar सतह पर अलग किया जा सकता है क्योंकि कागज या पतली परत क्रोमैटोग्राफी (पीसी या टीएलसी) द्वारा विभाजन सुविधाजनक हैं. पृथक्करण कुछ यौगिकों पी लेनेवाला (पीसी के मामले में सेल्यूलोज, और टीएलसी के मामले में Adsorbents की एक किस्म) को कसकर बाध्यकारी और दूसरों को कम से कम 1 पलायन के साथ, ध्रुवता पर आधारित है. संख्या 1 के सापेक्ष स्थिति का एक उदाहरण प्रदान करता है एक सिलिका टीएलसी थाली पर जुदाई के बाद ध्रुवीय और nonpolar phenolic यौगिकों.
चित्रा 1. एक सिलिका पतली परत chromatographic (टीएलसी) प्लेट पर अलग होने के बाद अलग छोर के यौगिकों का वितरण illustrating आरेख. लाल तिपतिया घास (Trifolium pratense एल) के फिनोलिक यौगिकों एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. ऐसे clovamide के रूप में ध्रुवीय यौगिकों,,, सिलिका की तरह एक ध्रुवीय पी लेनेवाला के लिए एक मजबूत संबंध हैं और मूल (या) के पास रहते हैं, जबकि इस तरह के विलायक सामने के पास तीन isoflavones (एस एफ), विभाजन और अधिक आसानी से विलायकों में के रूप में कम ध्रुवीय यौगिकों, (पानी, एसिड, या कुर्सियां शामिल किए गए हैं, जब तक कि सिलिका से भी कम ध्रुवीय हैं) और आगे थाली ऊपर की ओर पलायन.
एक टीएलसी थाली पर एक उद्धरण की जुदाई के बाद, परीक्षण सूक्ष्मजीवों इस प्रकार एक उद्धरण 2 के सक्रिय घटकों की पहचान तेजी, थाली पर सभी यौगिकों से अवगत कराया जा सकता है. एक कवक या जीवाणु संस्कृति वर्णलेख के संपर्क में है, तो माइक्रोबियल विकास विकास अवरोध करनेवाला के साथ क्षेत्रों में छोड़कर हर जगह पाए जाते हैं जाएगाY यौगिकों. निषेध के क्षेत्रों तब कवक 3 लागू किया गया है अगर mycelial विकास और विकास से मुक्त क्षेत्रों के बीच विपरीत देख कर या कोशिकाओं 4 रहने से कम या hydrolyzed जब रंग बदलने कि यौगिकों के साथ छिड़काव द्वारा देखे जा सकते हैं. रोगाणुरोधी assays के लिए कागज या पतली परत chromatograms का उपयोग पहली एंटीबायोटिक दवाओं 5 और fungicides 3,6 करने के लिए लागू किया गया था हालांकि, संयंत्र निष्कर्षों अब अक्सर अक्सर bioautography के रूप में निर्दिष्ट इस विधि के साथ रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए जांच कर रहे हैं. वर्णित प्रोटोकॉल के साथ साथ पतली परत chromatograms के bioautography पर लागू होते हैं. यह अपेक्षाकृत तेजी से है और विभिन्न Adsorbents (जैसे सिलिका, स्टार्च, एल्यूमिना), के रूप में भी अच्छा संकल्प और संवेदनशीलता 1 प्रदान करने पर किया जा सकता है क्योंकि टीएलसी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है.
पौधों के अर्क कई मायनों में टीएलसी के लिए तैयार किया जा सकता है. आम तरीकों कृत्रिम अंग केन्द्र में निकालने संयंत्र सामग्री शामिलऐसे संभवतः एसिड या आधार 9 के अलावा के साथ 80% इथेनॉल 7,8, के रूप में ohol पानी के मिश्रण. वे एक न्यूनतम मात्रा में टीएलसी प्लेटों के लिए लागू किया जा सकता है, ताकि कुछ पानी रोकने और संभवतः अम्लीय या बुनियादी रहे हैं जो इस तरह के विलायकों, में एक निकासी के बाद, अर्क केंद्रित किया जाना चाहिए. शराब से पानी के अर्क की एकाग्रता पानी अमिश्रणीय कार्बनिक विलायकों 8 के साथ या इस तरह के एथिल एसीटेट एथिल ईथर (1:1, वी / वी) 10,11 जैसे विलायकों, का एक मिश्रण के साथ विभाजन से हासिल किया जा सकता है. विभिन्न संयंत्र मेटाबोलाइट्स उनके छोर पर निर्भर करता है, विभिन्न कार्बनिक विलायकों में निकाले जाते हैं. संयंत्र है कि कार्बनिक अम्ल या ठिकानों इस स्तर पर कार्बनिक विलायकों में निकाला हैं सुनिश्चित करने के लिए, एक शराब का पानी निकालने के पीएच उठाया या तो कर रहे हैं, जो उनके nondissociated रूपों में अलग analytes कन्वर्ट करने के लिए एक पानी में घुलनशील एसिड या आधार के साथ उतारा जा सकता है तटस्थ कार्बनिक विलायकों 9 में घुलनशील. जैविक चरण तो ई किया जा सकता हैकम दबाव के तहत या नाइट्रोजन के तहत vaporated और टीएलसी के लिए वांछित मात्रा को समायोजित. निकालने के पीएच तटस्थ विलायकों, छोटे अंतिम मात्रा, और पूर्व जुदाई के लिए टीएलसी थाली पर निकालने का वाष्पीकरण में analytes के विभाजन की वजह से bioassay सूक्ष्मजीवों के लिए घातक होने की संभावना नहीं है.
कवक और बैक्टीरिया दोनों 2 निकालता संयंत्र की bioautography में परीक्षण सूक्ष्मजीवों के रूप में कार्यरत हैं. एक पोषक तत्व समाधान में प्लेटों पर छिड़काव किया और कई दिन 3 के लिए एक नम वातावरण में incubated अगर ऐसी Cladosporium cucumerinum के रूप में कुछ कवक के बीजाणु, (अलावा निरोधात्मक यौगिकों के साथ क्षेत्रों से) टीएलसी प्लेटों पर उगना. सी. के अंधेरे फुई noninhibitory क्षेत्रों पर cucumerinum mycelial विकास के मुक्त क्षेत्र के लिए एक तेज विपरीत प्रदान करता है. बैक्टीरिया में एक ही तरीके 4,12 में पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) प्लेटों के लिए लागू किया गया है, जीवाणु भी टीएलसी पर डालते रहे हैंअगर में थाली सतहों 13,14 overlays. ऐसे Candida albicans के रूप में खमीर,, साथ ही 14 अगर ओवरले में लागू किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, टीएलसी प्लेटें बैक्टीरिया 10,15 या खमीर 8, संपर्क bioautography 2 के रूप में जाना विधि के साथ inoculated अगर पर नीचे चेहरा रखा जा सकता है.
हम लाल तिपतिया घास (Trifolium pratense CV. Kenland) से रोगाणुरोधी phenolic यौगिकों के लिए स्क्रीन संपर्क bioautography के लिए एक विधि का वर्णन. परीक्षण सूक्ष्मजीव क्लोस्ट्रीडियम sticklandii, एक ruminal हाइपर अमोनिया उत्पादन जीवाणु (HAB) और आग्रही वातनिरपेक्षी है. इस्तेमाल किया विभाजन निकालने के सभी घटकों को हल नहीं करते हैं, वे इस प्रकार संभव रोगाणुरोधी यौगिकों के पूल संकुचन, रोगाणुरोधी गतिविधि के क्षेत्रों की पहचान की सुविधा. प्रोटोकॉल टीएलसी 1 के लिए मानक प्रक्रियाओं का इस्तेमाल करता. प्रोटोकॉल भी संवर्धन obli के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णनइस तरह के एक परख के लिए गेट anaerobes, जीवित कोशिकाओं 2,4 दाग जो एक tetrazolium नमक, साथ संपर्क bioautography 15 और एक दृश्य विधि का उपयोग.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल यौगिकों के सबसेट में एक उद्धरण को अलग करने और संपर्क bioautography द्वारा उन कैंपेन्स परख करने की क्रिया के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है. विधि सूजाक बैक्टीरिया पैदा करने के लिए निरोधात्मक संयं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें इस अध्ययन के लिए अपने लाल तिपतिया घास भूखंडों से नमूने का उपयोग करने की अनुमति के लिए, स्वर्गीय डॉ. नॉर्म टेलर, विभाग प्लांट और केंटकी के विश्वविद्यालय में मृदा विज्ञान धन्यवाद. इस परियोजना के कृषि संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
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