İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak
Summary
Yöntem bitki özleri, ince katman kromatografisi (TLC) ile ayırma antibakteriyel metabolitlerin tespit etmek için iletişim bioautography açıklanmaktadır. Yöntem sığır işkembe için yerel aşırı amonyak üreten bakteri (HAB) inhibe kırmızı yonca fenolik bileşiklerin taranması uygulanır.
Abstract
Bitki antimikrobiyal bileşikler için ortak bir elek (örneğin, bakteri veya mantarların suyu içinde veya agar), mikroplar için zaman büyümeye izin veren mikrobiyal süspansiyonlar için kromatogramlar maruz bırakılması, kağıt ya da ince-tabaka kromatografisi (PC veya TLC) ile ayırma bitki özleri oluşmaktadır nemli bir ortam, ve mikrobik büyüme bölgeleri görselleştirme. Bioautography olarak bilinen bu tarama yönteminin, etkinliği, kromatografik ayırma kalitesi ve mikrobiyal kültür koşulları ile alınan bakım hem de bağlıdır. Bu kağıt asit fermente bakterileri amino yeni bir uygulama ile TLC ve temas bioautography için standart protokoller açıklanmaktadır. Ekstre esnek (alüminyum destekli), silika TLC plakaları üzerinde ayrılmış ve bantlar ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirilebilir. Bölgeleri Test mikroorganizma ile aşılanmış agar üzerine kesilmiş ve yüzü aşağı inkübe edilir. İnhibitör grupları agar plaka lekeleme ile görselleştirildis ile tetrazolyum kırmızı. Yöntem, kırmızı yonca ayrılmasından (Trifolium pratense ev. Kenland) fenolik bileşikler ve Clostridium sticklandii, sığır işkembe özgüdür bir hiper amonyak üreten bir bakterinin (HAB) karşı aktivite için, bunların yapılan tarama uygulanır. TLC yöntemleri (aerobik veya anaerobik), hem de mantar bitki özleri ve diğer bakteri türleri arasında, çok çeşitli kültür koşulları için geçerlidir türün büyüme gereklerine uyacak şekilde tadil edilmiş halinde, test organizmalarının olarak kullanılabilir.
Introduction
Bitkilerde antimikrobiyal bileşikler için tahlil, bir bitki ekstraktı bileşenlerinin ayrılması ve bu bileşenlerin, bir test mikroorganizmanın maruz bırakılması, ve mikroorganizmaların büyüme bileşiklerin herhangi biri ile inhibe olup olmadığının belirlenmesini gerektirir. Birçok bileşik düzlemsel bir yüzeye ayrılabilir, çünkü kağıt veya ince tabakalı kromatografi (PC veya TLC) ile Separations uygundur. Ayırma bazı bileşikler, adsorban (PC durumunda selüloz, ve TLC durumunda adsorbanların çeşitli) sıkıca bağlanması ve diğerlerine 1 daha az geçirme ile, polarite dayanmaktadır. Şekil 1, göreli pozisyonlarının bir örnek teşkil silis TLC plakası üzerinde ayrılmasından sonra, polar ve polar olmayan fenolik bileşikler.
Şekil 1. Bir silika ince tabakalı kromatografi (TLC) üzerinde plaka ayrıldıktan sonra farklı polariteye sahip bileşiklerin dağılımı gösteren bir diyagramdır. Kırmızı yonca (Trifolium pratense L.) fenolik bileşikler, bir örnek olarak kullanılmaktadır. Örneğin clovamide gibi Polar bileşikler, silika gibi bir polar adsorban için güçlü bir afiniteye sahip ve kökeni (OR) yakın devam ederken böyle bir çözücü önünde yakınındaki üç izoflavon (SF), bölme daha kolay çözücü içine daha az polar bileşikler, (su, asitler, bazlar ya da içerdiği sürece, silika daha az polar olan) ve daha uzak plaka yukarı göç ederler.
Bir TLC plakası üzerinde bir ekstresinin ayrılmasından sonra, deney mikroorganizmalar bu nedenle bir özü 2'nin aktif bileşenlerinin tanımlanmasını hız, plaka üzerinde tüm bileşiklere maruz kalabilir. , Bir mantar ya da bakteri kültürü kromatogramında maruz kalırsa, mikrobiyal büyüme büyüme inhibitörü olan alanlarda dışında her yerde ortaya çıkary bileşikler yer alır. Engel bölgeleri daha sonra mantar 3 uygulanmış olması halinde miselial büyüme ve büyüme içermeyen alanlar arasındaki kontrast gözlemleyerek ya da canlı hücreler 4 azaltılabilir ya da hidrolize edilmiş renk değiştiren bileşiklerle püskürtme ile görselleştirilebilir. Antimikrobiyal tahliller için kağıt veya ince tabakalı kromatogramların kullanımı ilk antibiyotik 5 ve mantar öldürücüler 3,6 uygulandı, ancak, bitki ekstreleri, sık sık bioautography olarak adlandırılan bu yöntemle antimikrobiyal bileşikler için taranmaktadır. Bu buluşta tarif edilen protokoller, ince tabakalı kromatogramların bioautography için de geçerlidir. Nispeten hızlıdır ve farklı adsorban (örneğin, silika, nişasta, alümina), hem de iyi bir çözünürlük ve hassasiyeti 1 sağlanması gerçekleştirilebilir, çünkü TLC yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bitki özleri birçok yönden TLC için hazırlanabilir. Yaygın yöntemler ALC açılan bitki materyali içerirörneğin muhtemelen bir asit veya baz 9 eklenmesiyle% 80 etanol 7,8 yanı ohol-su karışımları. Bir minimal hacimde TLC plakalarına tatbik edilebilir, böylece bir miktar su içerir ve muhtemelen, asidik veya bazik olan bu gibi çözgenler içinde, bir ekstre edilmesinden sonra, ekstreler konsantre edilmelidir. Alkol-su özleri konsantrasyonu, su ile karışmayan bir organik çözücü 8 ile ya da etil asetat-etil eter (1:1, v / v) 10,11 gibi çözücülerin bir karışımı ile bölünmesi ile elde edilebilir. Farklı bitki metabolitleri, kutupları bağlı olarak, farklı bir organik çözücü içine ekstre edilmektedir. Bu bitki, organik asitler ya da bazlar, bu aşamada, organik çözücüler ile ekstre emin olmak için, bir alkol-su ekstrenin pH yükseltilmiş veya daha sonra da nondissociated formları haline ayrışmış analitlerin dönüştürmek için bir suda çözünür bir asit veya baz ile düşürülebilir nötr organik çözücü 9 çözünür. Organik faz daha sonra e olabilir,indirgenmiş basınç altında ya da azot altında vaporated ve TLC için istenen hacme ayarlanabilir. Ekstrenin pH nötr solventler, küçük bir nihai hacme, önceki ayırma TLC plakası üzerinde ekstraktın buharlaştırılması içine analitlerin bölünmesi nedeniyle biyolojik tayin mikroorganizmalar için öldürücü olması pek mümkün değildir.
Mantar ve bakteri her ikisi de 2, bitki ekstrelerinin bioautography test mikroorganizmalar gibi kullanılır. Bir besleyici çözelti içinde plakalar üzerine püskürtülür ve birkaç gün 3 boyunca nemli bir ortamda inkübe bu tür Cladosporium cucumerinum gibi bazı mantarlar, sporları, (ayrı önleyici bileşikler ile alanlardan) TLC plakalar üzerinde filizlenmesi. C. karanlık miselyum noninhibitory bölgeler üzerinde cucumerinum misel büyüme serbest bölgelere keskin bir kontrast sağlar. Bakteriler ile aynı şekilde 4,12 ince tabakalı kromatografi (TLC) plakaları uygulanmış olsa da, bakteriler, TLC üzerinde dökülüragar plaka yüzeyleri 13,14 bindirmeleri. Örneğin Candida albicans gibi maya, hem de 14 agar kaplamalar olarak uygulanabilir. Seçenek olarak ise, TLC levhaları, bakteri ya da maya 8 10,15, kontak bioautography 2 olarak bilinen bir yöntem ile aşılanmış agar üzerine yüzü aşağı yerleştirilebilir.
Bu, kırmızı yonca (Trifolium pratense ev. Kenland) için antimikrobiyal fenolik bileşiklerin taranması için temas bioautography için bir yöntem tarif eder. Test mikroorganizma Clostridium sticklandii, bir rumen hiper amonyak üreten bakteri (HAB) ve anaerob zorunlu olduğunu. Kullanılan ayırma ekstrenin tüm bileşenlerini gidermek de, böylece olası antimikrobiyal bileşiklerin havuz daralma, antimikrobiyal aktivite bölgelerin belirlenmesini kolaylaştırır. Protokol TLC 1 için standart yöntemler kullanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda kültür obli için gerekli olan bazı teknikler açıklanmaktadırBöyle bir tahlil için kapı anaeroblar canlı hücreler 2,4 lekeleyen bir tetrazolyum tuzu ile temas bioautography 15 ve bir görselleştirme yöntemi, bir kullanım.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol bileşikler alt-grup halinde bir özü ayrılması ve kontakt bioautography ile bu alt kümeleri test etmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Yöntem, belsoğukluğu neden olan bakteriler için inhibitör bitki metabolitleri için ekrana Chomnawang ve ark. 15 tarafından kullanılan birine oldukça benzer. Antimikrobiyal bitkisel bileşikler için ekrana kullanılan bioautography tipi testi mikroorganizma, laboratuar kurulumu ve biyodeney gerçekleştiren kişi (ler) tercihlerine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bize bu çalışma için onun kırmızı yonca parsellerden örnekleri kullanmak için izin için, merhum Dr Norm Taylor, Bölümü Bitki ve Kentucky Üniversitesi Toprak Bilimi teşekkür ederim. Bu proje Tarım Amerika Birleşik Devletleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. . Thin-layer chromatography. , (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 .
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. . The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 .
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
