वायरस के संक्रमण जन्मजात गढ़ पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) से शुरू हो रहे हैं. दो cytoplasmic PRRs रिग, मैं और वायरल हस्ताक्षर RNAs, परिवर्तन रचना, oligomerize, और antiviral संकेतन सक्रिय करने के लिए PKR बाँध. तरीके आसानी से गठनात्मक स्विचिंग और इन cytoplasmic PRRs की oligomerization निगरानी करने की अनुमति जो वर्णित हैं.
वायरस के संक्रमण को होस्ट गढ़ सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) द्वारा एक तेजी से पता लगाने पर निर्भर हैं. कोशिका द्रव्य में, PRRs रिग, मैं और विशिष्ट वायरल शाही सेना ligands के लिए PKR बाँध. यह पहला गठनात्मक स्विचिंग और oligomerization mediates, और फिर एक एंटीवायरल इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया के सक्रियण सक्षम बनाता है. एंटीवायरल मेजबान जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए तरीकों अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, सीधे रिग, मैं और PKR के सक्रियण राज्यों पर नजर रखने के तरीकों केवल आंशिक रूप से कर रहे हैं और कम अच्छी तरह से स्थापित.
यहाँ, हम एक स्थापित इंटरफेरॉन inducer, दरार घाटी बुखार वायरस उत्परिवर्ती क्लोन 13 (सीएल 13) के साथ संक्रमण पर रिग, मैं और PKR उत्तेजना नजर रखने के लिए दो विधियों का वर्णन. लिमिटेड trypsin पाचन PRRs के गठनात्मक परिवर्तन का संकेत है, प्रोटीज संवेदनशीलता में परिवर्तन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. रिग, मैं और PKR, wherea की एक तेजी से गिरावट में नकली संक्रमित कोशिकाओं के परिणाम से lysates के trypsin पाचनएस सीएल 13 संक्रमण एक प्रोटीज प्रतिरोधी रिग, मैं टुकड़ा के उद्भव की ओर जाता है. इसके अलावा PKR Thr 446 पर अपने बानगी phosphorylation के साथ मेल खाता है, जो trypsin पाचन, एक वायरस प्रेरित आंशिक प्रतिरोध से पता चलता है. रिग, मैं और PKR oligomers देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा मान्य किया गया था का गठन. इन प्रोटीनों नकली संक्रमित नमूनों में monomers के रूप में बने रहे, जबकि संक्रमण पर, रिग, मैं और PKR oligomeric परिसरों की एक मजबूत संचय, वहाँ है.
लिमिटेड प्रोटीज पाचन और देशी पृष्ठ, रिग, मैं और PKR सक्रियण के दो विभिन्न चरणों की एक संवेदनशील और प्रत्यक्ष माप की अनुमति, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए मिलकर दोनों. इन तकनीकों में अपेक्षाकृत आसान और प्रदर्शन करने के लिए जल्दी कर रहे हैं और महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है.
एंटीवायरल मेजबान बचाव में एक महत्वपूर्ण घटना तथाकथित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) 1,2 द्वारा रोगज़नक़ का तेजी से पता लगाने है. आरएनए वायरस के संक्रमण के intracellular पता लगाने के दो cytoplasmic आरएनए helicases, रिग, मैं (retinoic एसिड inducible जीन मैं) और MDA5 (मेलेनोमा भेदभाव जुड़े प्रोटीन 5) 3-5 पर निर्भर है. रिग, मैं दो एन टर्मिनल कस्पासे भर्ती डोमेन (कार्ड), एक केंद्रीय Dech बॉक्स प्रकार शाही सेना helicase डोमेन, और एक सी टर्मिनल डोमेन (CTD) 4,6 से बना है. CTD और helicase डोमेन गैर आत्म (वायरल) RNAs की मान्यता के लिए आवश्यक हैं, जबकि कार्ड एक एंटीवायरल मेजबान स्थिति की स्थापना के लिए अग्रणी बहाव के संकेत मध्यस्थता.
रिग, मैं एक विशिष्ट शाही सेना ligand के अभाव में यानी मूक राज्य में है, तो दूसरा कार्ड केंद्रीय helicase डोमेन के साथ सूचना का आदान प्रदान और एक ऑटो निरोधात्मक रचना 7-11 में रिग, मैं रहता है. रिग, मैं कम करने के लिए बांध डबलएक 5'-triphosphate (5'PPP), लंबे dsRNA, और Polyu / यू सी युक्त शाही सेना, कई आरएनए वायरस 12-16 के जीनोम पर मौजूद हैं, जो क्लासिक हस्ताक्षर संरचनाओं असर किनारा (डीएस) आरएनए. रिग, मैं सक्रियण की दो प्रमुख विशेषताएं एक बंद रचना 6,17 और होमोसेक्सुअल oligomerization 6,18,19 के लिए एक स्विच कर रहे हैं. गठनात्मक स्विच, शाही सेना बाध्यकारी बढ़ाता बहाव के संकेत के लिए कार्ड को उजागर करता है, और एक सक्रिय ATPase साइट 8,9,11,20 reconstitutes. oligomeric रिग, मैं परिसरों के गठन एंटीवायरल संकेत पारगमन 11 के लिए एक मंच के लिए फार्म का बहाव के संकेत अनुकूलक अणुओं की बढ़ी भर्ती करने के लिए ले जाता है. रिग, मैं विनियमित संकेत श्रृंखला अंततः प्रतिलेखन कारक सक्रिय हो IRF-3 के लिए ऊपर विनियमन एक पूर्ण antiviral प्रतिक्रिया 21,22 के लिए इंटरफेरॉन (IFN-alpha/beta) जीन और इंटरफेरॉन उत्तेजित जीन की इसलिए जीन अभिव्यक्ति (ISGs) की . सर्वश्रेष्ठ विशेषता ISGs से एक शाही सेना सक्रिय protei हैn kinase (PKR) 23. PKR यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 2 अल्फा (eIF2α) kinases के परिवार के अंतर्गत आता है और एक एन टर्मिनल डबल असहाय शाही सेना बाध्यकारी डोमेन और एक सी टर्मिनल kinase डोमेन से बना है. kinase डोमेन PKR सक्रियण के लिए dimerization इंटरफ़ेस महत्वपूर्ण गठन और प्रोटीन का उत्प्रेरक कार्य करता है. वायरल dsRNA को PKR के बंधन इसके गठनात्मक परिवर्तन अन्य अवशेषों के बीच Thr 446 पर dimerization और ऑटो phosphorylation की अनुमति की ओर जाता है. PKR तो जिससे वायरल mRNAs 23-27 का अनुवाद अवरुद्ध, eIF2α की phosphorylation मध्यस्थता करता है.
रिग, मैं और PKR दोनों, प्रमुख संरचनात्मक rearrangements गुजरना oligomeric परिसरों फार्म और बाद translationally phosphorylation / dephosphorylation और ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29 द्वारा संशोधित कर रहे हैं. वायरल शाही सेना संरचनाओं रिग, मैं और PKR सक्रिय कर रहे हैं (और क्या मंच पर वायरल विरोधी ख सकता है जो की एक बेहतर समझ के लिएई) हस्तक्षेप, यह ठीक सक्रियण स्थिति निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. दोनों PRRs के लिए यह पहले से सक्रियण trypsin प्रतिरोधी प्रोटीन टुकड़े 6,17,30 और उच्च आदेश oligomers 6,18,19 के उद्भव की ओर जाता है कि वर्णित किया गया था. हालांकि, एंटीवायरल मेजबान प्रतिक्रिया 1,2,24 के इन महत्वपूर्ण कारकों पर साहित्य का धन दिया, प्रत्यक्ष तरीकों के आवेदन अपेक्षाकृत दुर्लभ लगता है. व्यापक उपयोग के उत्तेजक की आशा में, हम मजबूती के साथ रिग, मैं और PKR के सक्रियण राज्यों का विश्लेषण करने के लिए सुविधाजनक और संवेदनशील प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. IFN सक्षम मानव कोशिका लाइन A549 रिग, मैं और PKR, तनु दरार घाटी बुखार वायरस उत्परिवर्ती क्लोन 13 (सीएल 13) 31,32 के एक स्थापित उत्प्रेरक से संक्रमित है. एक सरल lysing प्रक्रिया के बाद, संक्रमित कोशिकाओं के अर्क गठनात्मक स्विचिंग का मूल्यांकन करने के लिए सीमित trypsin पाचन / पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जाता है, और नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) / पश्चिमी धब्बा analys द्वाराoligomers के गठन को मापने के लिए है.
वायरस की उपस्थिति और मैं प्रणाली IFN एंटीवायरल प्रकार की सक्रियता सेंसिंग सफल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22 के लिए महत्वपूर्ण हैं. वायरस का पता लगाने जिससे एक तेजी से प्रतिक्रिया और antiviral सुरक्षा तंत?…
The authors have nothing to disclose.
हम विरोधी दरार घाटी बुखार वायरस सीरा उपलब्ध कराने के लिए CISA-Inia से ऐलेजैंड्रो ब्रुन धन्यवाद. हमारी प्रयोगशालाओं में काम Forschungsförderung मणि द्वारा समर्थित है. 2 पेट §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum गिएस्सेन und मारबर्ग, उभरते वायरल रोगों के लिए लाइबनिट्स ग्रेजुएट स्कूल (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, और DFG Schwerpunktprogramm (एसपीपी) 1596.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
cell culture | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
chemicals | |||
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
antibodies | |||
mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |