Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ
Summary
Врожденные защиты в вирусных инфекций вызываются распознающих рецепторов (РРСС). Два цитоплазматические РРСС RIG-I и PKR связываются с вирусными подписи РНК, изменение конформации, олигомеризоваться и активируйте антивирусную сигнализацию. Описаны методы, которые позволяют легко контролировать конформационное переключение и олигомеризации этих цитоплазматических PRRS.
Abstract
Защитные силы организма вирусной инфекции зависят от быстрого обнаружения по распознающих рецепторов (РРСС) врожденной иммунной системы. В цитоплазме, что РРСС RIG-I и PKR связываются со специфическими вирусными РНК лигандов. Этот первый посредником конформационную коммутации и олигомеризации, а затем позволяет активацию противовирусного ответа интерферона. В то время как методы измерения противовирусной экспрессию генов хозяина, хорошо известны, методы непосредственно отслеживающие активации состояния RIG-I и PKR лишь частично и не прижилось.
Здесь мы описываем два метода для мониторинга RIG-I и PKR стимуляции при инфицировании установленном индуктор интерферона, вирус лихорадки долины Рифт мутант клона 13 (Cl 13). Общество с ограниченной трипсин-переваривание позволяет анализировать изменения в чувствительности протеазы, указывая конформационные изменения в PRRS. Трипсин переваривание лизатов макет инфицированных клеток приводит к быстрой деградации RIG-I и PKR, где ас Cl 13 инфекция приводит к появлению протеазы устойчивостью RIG-I фрагмента. Также PKR показывает вирус-индуцированной частичное сопротивление трипсина пищеварения, который совпадает с Его отличительной чертой фосфорилирования в Thr 446. Формирование RIG-I и PKR олигомеры была подтверждена с помощью электрофореза родной полиакриламидном геле (PAGE). При заражении существует сильная накопление RIG-I и PKR олигомерных комплексов, в то время как эти белки оставались в качестве мономеров в ложном зараженных образцов.
Общество с ограниченной протеазы пищеварение и родной СТР, как в сочетании с Вестерн-блоттинга, позволяют чувствительный и прямое измерение двух различных ступенях RIG-I и PKR активации. Эти методы могут быть сравнительно легко и быстро выполнять и не требует дорогостоящего оборудования.
Introduction
Важнейшим событием в противовирусной защиты организма является быстрое обнаружение возбудителя на так называемых распознающих рецепторов (РРСС) 1,2. Внутриклеточный обнаружение вируса РНК-инфекции зависит от двух цитоплазматической РНК геликаз, RIG-I (ретиноевой кислоты индуцируемый ген I) и MDA5 (дифференциация меланома ассоциированный белок 5) 3-5. RIG-I состоит из двух N-концевых доменов набора каспазы (карты), центрального типа Dech ящик РНК геликазы области, и С-концевого домена (CTD) 4,6. В то время как КТР и геликазного домена необходимы для признания неавтомодельных (вирусных) РНК, карты посредником нижестоящую передачу сигналов, ведущих к созданию противовирусного статуса хозяина.
Если RIG-I находится в состояние молчания, то есть в отсутствие конкретного РНК лиганда, вторая карта взаимодействует с центральной области геликазы и держит RIG-I в автомобильной ингибирования конформации 7-11. RIG-I связывается с коротким дваждынить (DS) РНК, несущий 5'-трифосфат (5'PPP), длинные дцРНК, и полиУ / UC-богатую РНК, классические подписи структур, которые присутствуют на геномах многих РНК-содержащих вирусов 12-16. Два основных характеристики активации RIG-I являются переход к закрытой конформации 6,17 и гомо-олигомеризации 6,18,19. Конформационное переключатель усиливает связывание РНК, предоставляет карты для передачи сигнала, и воссоздает активное АТФазную сайт 8,9,11,20. Формирование олигомерных комплексов RIG-I приводит к увеличению набора последующих молекул адаптера сигнализации, чтобы сформировать платформу для противовирусной передачи сигнала 11. RIG-I-регулируется цепи сигнализации в конечном счете активирует фактор транскрипции IRF-3 для повышающей регуляции интерферона (IFN-alpha/beta) генов и, следовательно, экспрессии генов интерферона стимулируется генов (ISGs) для полного противовирусного ответа 21,22 . Один из лучше всего характеризует ISGs является РНК-активированный Протейн киназы (PKR) 23. PKR принадлежит к семейству эукариотической инициации трансляции фактор 2 альфа (eIF2α) киназ и состоит из N-концевого двухцепочечной РНК-связывающего домена и С-концевого домена киназы. Киназный домен представляет собой интерфейс димеризации решающее значение для PKR активации и осуществляет каталитические функции белка. Связывание PKR вирусной дсРНК приводит к ее изменение конформации разрешений димеризацию и авто-фосфорилирования в Thr 446 среди других остатков. PKR затем согласует фосфорилирования eIF2α, тем самым блокируя перевод вирусной мРНК 23-27.
Оба RIG-I и PKR претерпит серьезных структурных перестроек, образуют олигомерные комплексы и посттрансляционно изменены фосфорилирования / дефосфорилирования и убиквитинирования 10,11,19,23,24,26-29. Для лучшего понимания которых вирусные РНК структуры активации RIG-I и PKR (и на какой стадии вирусные антагонисты могли Bе вмешательства), важно, чтобы точно определить состояние активации. Для обоих РРСС было ранее описано, что активация приводит к появлению трипсиноподобных устойчивы фрагментов белков 6,17,30 и более высокого порядка олигомеров 6,18,19. Однако, учитывая богатство литературы об этих ключевых факторов противовирусного ответа хозяина 1,2,24, применение прямых методов кажется сравнительно редко. В надежде стимулирования более широкого использования, мы предоставляем удобные и чувствительные протоколы решительно анализирующих активации состояния RIG-I и PKR. ИФН компетентным А549 линия клеток человека заражен с установленным активатором RIG-I и PKR, в ослабленный вирус лихорадки долины Рифт мутантного клона 13 (Cl 13) 31,32. После простой процедуры лизирующего, экстракты из инфицированных клеток испытаны ограниченной трипсин-переваривание / Вестерн-блот анализ, чтобы оценить конформационное переключение, и синим электрофореза в полиакриламидном геле с нативной (PAGE) / Western блот Analysзаключается в измерении образование олигомеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Почувствовав присутствие вирусов и активацию противовирусного IFN типа I системы имеют решающее значение для успешных врожденных иммунных реакций 22. Обнаружение Вирус тем самым опосредовано рецепторами распознавания патогена (РРСС), как RIG-I и PKR, что позволяет в кратчайшие сроки и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Алехандро Brun от CISA-INIA для обеспечения защиты от лихорадки Рифт-Валли Вирус сывороток. Работа в нашей лаборатории поддерживается Forschungsförderung камень. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Университетская Гиссен унд Марбург, Лейбниц Высшая школа для развивающихся вирусных заболеваний (Эйдис), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, и DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. . A structure-based model of RIG-I activation. 18, 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles’ recognition of 5′-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. . RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. , 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. . 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. 생화학. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5′-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
