Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo
Summary
Defensas innatas a las infecciones por virus son provocados por los receptores de reconocimiento de patrones (RRP). Los dos PRRs citoplasmáticos RIG-I y PKR se unen a los ARN virales de firma, cambio de conformación, oligomerize y activar la señalización antiviral. Se describen procedimientos que permiten controlar cómodamente el cambio conformacional y la oligomerización de estos derechos y responsabilidades parentales citoplasmáticos.
Abstract
Las defensas del huésped a la infección por virus dependen de una detección rápida por los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) del sistema inmune innato. En el citoplasma, los derechos y responsabilidades parentales RIG-I y PKR se unen a ligandos específicos de ARN viral. Esta primera media la conmutación conformacional y oligomerización y, a continuación, permite la activación de una respuesta antiviral de interferón. Si bien los métodos para medir la expresión de genes antivirales de acogida están bien establecidos, los métodos para supervisar directamente los estados de activación de RIG-I y PKR son sólo parcialmente y menos bien establecidos.
Aquí se describen dos métodos para controlar RIG-I y PKR estimulación tras la infección con un inductor de interferón establecido, el virus de la fiebre del Valle del Rift clon mutante 13 (Cl 13). Digestión con tripsina Limited permite analizar las alteraciones en la sensibilidad a la proteasa, lo que indica cambios conformacionales de los derechos y responsabilidades parentales. La digestión con tripsina de lisados de simulacros de las células infectadas como resultado una rápida degradación de RIG-I y PKR, whereas Cl 13 infección conduce a la aparición de un fragmento resistente a la proteasa RIG-I. También PKR muestra una resistencia parcial inducida por el virus de la digestión de la tripsina, que coincide con su fosforilación en Thr sello 446. La formación de RIG-I y oligómeros PKR fue validado por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE). Tras la infección, existe una fuerte acumulación de RIG-I y complejos oligoméricos PKR, mientras que estas proteínas se mantuvieron como monómeros en muestras infectados de forma simulada.
Digestión con proteasa Limited y PAGE nativa, tanto acopladas a análisis de Western blot, permiten una medición sensible y directa de dos diversas etapas de RIG-I y la activación de PKR. Estas técnicas son relativamente fácil y rápido de realizar y no requieren equipos costosos.
Introduction
Un evento crucial en la defensa del huésped antiviral es la detección rápida del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón de llamadas (PRRS) 1,2. La detección intracelular de la infección por virus de ARN depende de dos helicasas de ARN citoplásmico, RIG-I (ácido retinoico de genes inducibles I) y MDA5 (proteína asociada a la diferenciación del melanoma 5) 3-5. RIG-I está compuesta por dos dominios N-terminales de reclutamiento de caspasas (tarjetas), un tipo DECH-box RNA helicasa dominio central, y un dominio C-terminal (CTD) de 4,6. Considerando que el CTD y el dominio helicasa se requieren para el reconocimiento de la no auto RNAs (virales), las tarjetas median la señalización corriente abajo que conduce a establecimiento de un estado anfitrión antiviral.
Si RIG-I está en el estado de silencio, es decir, en ausencia de un ligando de ARN específico, la segunda tarjeta interactúa con el dominio helicasa central y mantiene GAR-I en una conformación auto-inhibidor 7-11. RIG-I se une a corto doble-hebra (ds) de ARN que lleva un 5'-trifosfato (5'PPP), largo dsRNA, y polyU / UC-rica ARN, estructuras de firma clásicos que están presentes en los genomas de muchos virus de ARN 12-16. Dos características importantes de la activación de RIG-I son un cambio a una conformación cerrada 6,17 y la homo-oligomerización 6,18,19. El cambio conformacional mejora ARN vinculante, expone las tarjetas de señalización corriente abajo, y reconstituye un sitio ATPasa activa 8,9,11,20. La formación de complejos oligoméricos RIG-I conduce a una mayor captación de las moléculas adaptadoras de señalización aguas abajo para formar una plataforma para la transducción de señales antiviral 11. La cadena de señalización regulada por el RIG-I se activa con el tiempo el factor de transcripción IRF-3 para la regulación de interferón genes (IFN-alpha/beta) y por lo tanto la expresión génica de los genes de interferón estimulado (ISGs) para una respuesta antiviral completa 21,22 . Uno de los mejor caracterizados ISGs es la proteinuria ARN-activadon quinasa (PKR) 23. PKR pertenece a la familia de iniciación de la traducción eucariótica factor de 2 alfa (eIF2α) quinasas y se compone de un dominio de ARN de doble cadena de unión y un dominio C-terminal de la quinasa N-terminal. El dominio quinasa constituye la interfaz de dimerización crucial para la activación de PKR y lleva a cabo las funciones catalíticas de la proteína. La unión de PKR a dsRNA viral conduce a su cambio conformacional que permite la dimerización y auto-fosforilación en Thr 446, entre otros residuos. PKR continuación, media la fosforilación de eIF2α, bloqueando de este modo la traducción de los ARNm viral 23-27.
Tanto RIG-I y PKR sufrir importantes reajustes estructurales, forman complejos oligómeros y son después de la traducción modificado por fosforilación / desfosforilación y ubiquitinación 10,11,19,23,24,26-29. Para una mejor comprensión de lo que las estructuras de ARN virales están activando RIG-I y PKR (y en qué etapa antagonistas virales podrían be interferir), es importante determinar con precisión el estado de activación. Para ambos parentales que se ha descrito anteriormente que la activación conduce a la aparición de fragmentos de proteína resistente a tripsina 6,17,30 y oligómeros de orden superior 6,18,19. Sin embargo, dada la gran cantidad de literatura sobre estos factores clave de la respuesta del huésped antiviral 1,2,24, la aplicación de métodos directos parece relativamente rara. En la esperanza de estimular el uso más amplio, ofrecemos protocolos convenientes y sensibles para analizar con firmeza los estados de activación de RIG-I y PKR. El IFN competente línea celular humana A549 está infectado con un activador establecida de RIG-I y PKR, el virus de la fiebre del Valle del Rift atenuada clon mutante 13 (Cl 13) 31,32. Después de un procedimiento de lisis simple, los extractos de células infectadas se prueban por digestión análisis de transferencia limitada tripsina / Western para evaluar conmutación conformacional, y por azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (PAGE) / Analys Western blotes medir la formación de oligómeros.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detección de la presencia de virus y la activación del sistema de tipo antiviral I IFN son cruciales para la respuesta inmune innata de éxito 22. La detección de virus es por ello mediado por los receptores de reconocimiento de patógenos (PRRS) como RIG-I y PKR, lo que permite una respuesta rápida y la activación de mecanismos de defensa antiviral. Aquí se describen dos métodos para evaluar directamente el estado de activación de RIG-I y PKR.
Digestión con proteasa Limi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Alejandro Brun de CISA-INIA para proporcionar anti-sueros Rift La fiebre del valle Virus. El trabajo en nuestros laboratorios se apoya en Forschungsförderung joya. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Escuela de Graduados de Leibniz para las enfermedades virales emergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, y la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. . A structure-based model of RIG-I activation. 18, 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles’ recognition of 5′-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. . RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. , 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. . 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. 생화학. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5′-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
