抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化
Summary
ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。
Abstract
ウイルス感染に対する宿主防御は、自然免疫系のパターン認識受容体（PRR）による迅速な検出に依存している。細胞質内に、PRRは、RIG-IおよびPKRは、特定のウイルスRNAリガンドに結合する。これは、最初のコンホメーションのスイッチングおよびオリゴマー化を媒介し、その後、抗ウイルスインターフェロン応答の活性化を可能にします。抗ウイルス宿主遺伝子発現を測定するための方法は十分に確立されているが、直接、RIG-IおよびPKRの活性化状態をモニターする方法は、部分的にのみであり、以下で十分に確立。
ここでは、確立されたインターフェロン誘導剤、リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）の感染の際に、RIG-IおよびPKR刺激を監視するために二つの方法を説明します。限られたトリプシン消化は、PRRはの立体構造変化を示す、プロテアーゼ感受性の変化を分析することができます。 RIG-IとPKR、whereaの急速な劣化を模擬感染細胞の結果から溶解物のトリプシン消化S Clで13感染はプロテアーゼ耐性RIG-I断片の出現につながる。また、PKRは、Thr 446で、その特徴的なリン酸化と一致し、トリプシン消化にウイルス誘導部分の抵抗を示している。RIG-IとPKRオリゴマーの形成は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により検証された。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、感染の際に、RIG-IとPKRのオリゴマー複合体の強力な蓄積がある。
限られたプロテアーゼ消化し、ネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析に連結された両方が、RIG-IとPKR活性化の2多様な段階の感度で直接測定を可能にします。これらの技術は、実行するのが比較的容易かつ迅速であり、高価な装置を必要としない。
Introduction
抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要であるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。
RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5'-三リン酸（5'PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー6,17およびホモオリゴマー6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム11を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ（PKR）23。 PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA 23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。
RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化10,11,19,23,24,26-29によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片6,17,30及び高次オリゴマー6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルスや私は、システムをIFNの抗ウイルスタイプの活性化の存在を感知すると、成功した自然免疫応答22に重要である。ウイルス検出することにより迅速な応答および抗ウイルス防御機構の活性化を可能にする、RIG-IおよびPKRなどの病原体認識受容体（PRR）によって媒介される。ここでは、直接RIG-IおよびPKRの活性化状態を評価するために二つの方法を記載している。
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、反リフトバレー熱ウイルスの血清を提供するためのCISA-INIAからアレハンドロ·ブランに感謝します。私たちの研究室での作業はForschungsförderung宝石でサポートされています。 2腹筋を§。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikumギーセンウントマールブルグ、新興ウイルス性疾患のためのライプニッツ研究科（EIDIS）、DFG Sonderforschungsbereich（SFB）1021、およびDFG Schwerpunktprogramm（SPP）1596。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
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