פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב
Summary
תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.
Abstract
תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.
Introduction
מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. 15 N תיוג 1 וSILAC 2 להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו 3 ICAT, 4 iTRAQ, וdimethylation ההפחתה 5 להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.
תיוג רדה כרוך פפטידים מגיבים עם פורמלדהיד כדי ליצור בסיס שיף, אשר לאחר מכן מצטמצםעל ידי cyanoborohydride. תגובה זו dimethylates קבוצות אמינו חופשיות ברשתות N-Termini והצד ליזין וmonomethylates prolines N-מסוף. הפרוטוקול המתואר כאן methylates פפטידים במדגם 1 עם תווית "קלה" באמצעות ריאגנטים עם אטומי מימן בתפוצתם הטבעית איזוטופי ומדגם 2 עם תווית "כבדה" באמצעות פורמלדהיד deuterated וcyanoborohydride (איור 1). כל קבוצת אמין dimethylated על תוצאות פפטיד בהבדל המוני של 6.0377 דה בין אור וצורות כבדות, אשר מועסקות להבחין בין שתי צורות באמצעות ספקטרומטר מסה. באופן ספציפי, שכיחותם היחסית פפטיד הן לכמת כיחס בין אזורי הכרומתוגרמה יון MS1 חילוץ (יחס אזור שיא MS1) של אור והגרסה כבדה לכל זוג יונים פפטיד. השפע היחסי של חלבון מחושב כיחס אזור שיא MS1 החציוני בין כל פפטידים בחלבון. בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול חזק על התנהגותing ניסויי תיוג רדה ידי LC-MS/MS הכולל חילוץ התהפך שלב פפטיד מוצק שלב, תיוג רדה על עמודות, חלוקה פפטיד על ידי pH הבסיסי התהפך שלב כרומטוגרפיה (BPRP), וטיהור של תערובות הפפטיד באמצעות StageTips (איור 2) . אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של שימוש בתיוג רדה לפרוטאומיקה כמותית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
