Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling
Summary
Rotulagem de isótopos estáveis de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.
Abstract
Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.
Introduction
Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. 15N rotulagem 1 e 2 SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT 3, iTRAQ 4, e redução dimetilação 5 adicionar tags de isótopos estáveis após a extracção de proteína e de digestão. Entre esses métodos, dimetilação redutora (rotulagem Redi) está ganhando popularidade como um método barato e reprodutível para quantificar as diferenças de concentração de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.
Rotulagem Redi envolve péptidos que reagem com o formaldeído, para formar uma base de Schiff, a qual é então reduzidapor cianoborohidreto. Esta reacção dimethylates grupos amino livres no terminal N e cadeias laterais de lisina e monomethylates prolinas N-terminais. O protocolo aqui descrito metila péptidos em amostra 1 com um rótulo de "luz" usando reagentes com átomos de hidrogénio na sua distribuição isotópica natural e a amostra 2, com um rótulo "pesada" usando formaldeído deuterado e cianoborohidreto (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado sobre um péptido resulta numa diferença de massa de 6,0377 Da entre luz e formas, pesados, que são utilizados para distinguir entre as duas formas, utilizando um espectrómetro de massa. Especificamente, as abundâncias relativas de péptidos são quantificadas como a razão entre as áreas de cromatogramas de iões MS1 extraídos (MS1 razão de área de pico) da luz e da versão pesada para cada par de iões de péptidos. A abundância relativa de uma proteína é calculada como a razão da área do pico MS1 média entre todos os péptidos da proteína. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo robusto para condutaing Redi experiências de marcação por LC-MS/MS, que inclui o péptido de extracção de fase reversa em fase sólida, marcação Redi na coluna, o péptido de fraccionamento por pH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia, e purificação de misturas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Discutimos vantagens e limitações do uso de rotulagem Redi para proteômica quantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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