Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной
Summary
Стабильный изотоп маркировка пептидов восстановительным Диметилирование (Реди маркировки) является быстрым, недорогим стратегия для точных масс-спектрометрии на основе количественных протеомики. Здесь мы показываем, надежный метод для подготовки и анализа белковых смесей, используя подход Реди, который может быть применен к почти любого типа образца.
Abstract
Стабильный изотоп маркировка пептидов путем восстановительного Диметилирование (Реди маркировки) является методом для точного количественного различия экспрессии белка между образцами с использованием масс-спектрометрии. Реди маркировка выполняется с помощью либо обычный (свет) или дейтерированных (тяжелые) формы формальдегида и натрия цианоборогидрида добавить две метильные группы к каждому свободного амина. Здесь мы показываем, надежный протокол для Реди маркировки и количественного сравнения сложных белковых смесей. Образцы белка для сравнения перевариваются в пептиды, маркированные нести легком и тяжелом теги метил, смешиваются и совместно анализировали LC-MS/MS. Относительные распространенности белка количественно путем сравнения ион хроматограмме пиков тяжелых и легких меченых вариантов составного пептида, извлеченной из полного MS спектров. Описанный здесь метод включает пробоподготовки обращенно-фазовой экстракции твердой фазы, в колонку Реди маркировки пептидов, пептидов фракционирование по щелочного рН оборотовersed-фаза (BPRP) хроматографии и StageTip очистка пептида. Мы обсуждаем преимущества и ограничения Реди маркировки в отношении других методов стабильных изотопов регистрации. Мы подчеркиваем новых приложений с использованием Реди маркировке быстрой, недорогой и точный метод для сравнения белковых распространенность в почти любого типа образца.
Introduction
Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. 15 N маркировка 1 и 2 SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT 3, iTRAQ 4, и снижение Диметилирование 5 добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. Среди этих методов, восстановительное Диметилирование (Реди маркировка) набирает популярность как недорогой, воспроизводимый метод для количественного различия концентрации белка в почти любого типа образца.
Реди маркировки включает взаимодействие пептидов с формальдегидом с образованием основани Шиффа, которое затем восстанавливаютцианоборогидрид. Эта реакция dimethylates свободные аминогруппы на N-концах и лизин боковых цепей и monomethylates N-концевых пролинов. Протокол, описанный здесь метилирует пептиды в образце 1 с «легкой» этикетки с использованием реагентов с атомами водорода в их естественной распределения изотопного и образца 2 с «тяжелой» этикетки с использованием дейтерированных формальдегид и цианоборгидрид (рис. 1). Каждый диметилированный аминогруппу на пептида, приводит к разнице масс 6,0377 Da между легкой и тяжелой формы, который используется, чтобы различать между двумя формами с помощью масс-спектрометра. В частности, относительное содержание пептида количественно как отношение MS1, выделенных областей ионных хроматограмм (MS1 отношение площади пика) легкой и тяжелой версии для каждой пары пептид ионов. Относительное содержание белка определяется как отношение средней MS1 площади пика среди всех пептидов в белке. В этом докладе мы описываем надежную протокол для проведенияING Реди маркировки эксперименты по LC-MS/MS что включает в себя пептид твердофазного добычу обращенной фазой, на-колонке Реди маркировку, пептидный фракционирования по щелочного рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии и очистка пептидных смесей с помощью StageTips (рис. 2) . Мы обсудим возможности и ограничения использования Реди маркировку для количественных протеомики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько точек сделать стабильным изотопом маркировки пептидов с использованием привлекательным методом для количественных протеомики восстановительное Диметилирование (Реди маркировки): недорогие реагенты маркировки (реагенты стоить менее $ 1 на образец), высокая скорость реакци?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
