عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأنسجة لتحليل التعبير الجيني
Summary
غالبا ما تحتوي على الأنسجة ذبابة الفاكهة خليط غير متجانس من أنواع الخلايا. لدراسة التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة وجه الخصوص، يمكن الموسومة نوى وراثيا وعزل في وقت لاحق باستخدام النهج القائم على النسب. نواة معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل تحليل التعبير الجيني والكروماتين مناعي.
Abstract
غالبا ما تحتوي على الأنسجة الجنينية واليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن خليط غير متجانس للغاية من أنواع الخلايا، والتي يمكن تعقيد تحليل التعبير الجيني في هذه الأنسجة. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فإنه قد يكون من الضروري عزل أنواع معينة من الخلايا مع نقاء عالية وعلى عوائد كافية للتطبيقات المصب مثل النسخي والكروماتين مناعي. ومع ذلك، فإن التشكل الخلوية في أنسجة غير النظامية مثل الجهاز العصبي المركزي، إلى جانب السكان نادرة من أنواع معينة من الخلايا في هذه الأنسجة، يمكن أن تشكل تحديات للطرق التقليدية من العزلة الخلية مثل تسليخ مجهري الليزر والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) . هنا، وهو نهج بديل للتميز ملامح التعبير الجيني خلية محددة باستخدام العزلة القائم على تقارب من نوى الموسومة، بدلا من خلايا كله، يوصف. نوى في ج محددةنوع الذراع من الفائدة وصفت وراثيا مع المغلف النووية المترجمة علامة EGFP باستخدام نظام ثنائي التعبير GAL4/UAS. هذه النوى الموسومة EGFP يمكن أن تكون معزولة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP التي تقترن لحبات المغناطيسي. النهج الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح العزلة ثابت من نوى من أنواع معينة من الخلايا في النظام المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة العصبي في نقاء عالية وعلى مستويات كافية لتحليل التعبير، حتى عندما تشكل هذه أنواع الخلايا أقل من 2٪ من مجموع السكان في الخلية الأنسجة. ويمكن استخدام هذا النهج لعزل نواة من طائفة واسعة من ذبابة الفاكهة وأنواع الخلايا الجنينية اليرقات باستخدام برامج تشغيل GAL4 محددة، وربما يكون مفيدا في عزل نواة من أنواع الخلايا التي ليست مناسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية أو تسليخ مجهري الليزر.
Introduction
الأنسجة ذبابة الفاكهة مثل الجهاز العصبي المركزي تحتوي على خليط معقد من أنواع الخلايا. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فمن الضروري أولا لعزل السكان متجانسة من خلايا معينة بكميات كافية لتمكين التطبيقات المصب. وتشمل وسائل لعزل الخلايا من أنسجة سليمة تسليخ مجهري ليزر، والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) من الخلايا بأكملها. بينما نظام مراقبة الأصول الميدانية قد استخدمت لعزل الخلايا ونوى من أجنة ذبابة الفاكهة وانواع معينة ايليجانس من لونين والتعبير الجيني التنميط 1-3، ونظام مراقبة الأصول الميدانية تسليخ مجهري ليزر يمكن أن يكون صعبا لتنفيذ بنجاح في الأنسجة التي تحتوي على أنواع الخلايا تتشابك غاية أو أن الخلايا تحتوي على مع مورفولوجيا غير النظامية، مثل الخلايا العصبية. للتغلب على هذه الصعوبة، بدلا من نوى الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن أنواع معينة من الخلايا واستخدامها لاحقا الجنراله التنميط التعبير. الأهم من ذلك، مرنا تحليل التعبير المستندة ميكروأري باستخدام عينات الحمض النووي الريبي النووي تظهر نتائج مماثلة عموما مع أن تنفيذها باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع 4 و 5. وعلاوة على ذلك، وتحليل التعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي النووي وقد استخدم بنجاح لدراسة التعبير الجيني في الكائنات متعددة بما في ذلك C. ايليجانس، نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ذبابة الفاكهة، والبشر 4، 5 2، 3.
وقد تم مؤخرا وصفت عدة طرق لعزل السكان محددة من النوى وصفت من الأنسجة ذبابة الفاكهة التي هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني و / أو لونين مناعي. العزلة دفعة من لونين الأنسجة محددة لطريقة مناعي (بت رقاقة) يستخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل نواة ثابتة على أساس خلية من نوع معين من التعبير GFP المترجمة النووية 2. وكان هذا النهج سوتستخدم ccessfully لتحليل توزيع التعديلات هيستون وعوامل النسخ باستخدام لونين مناعي معزولة من نوى من الأديم المتوسط من أجنة ذبابة الفاكهة 2. ومع ذلك، قد يكون النهج القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية أقل مناسبة لعزل نواة المسمى التي تشكل إلا نسبة صغيرة من السكان مختلطة بسبب زيادة وقت الفرز اللازمة للحصول على أرقام مناسبة للتطبيقات المصب. للتغلب على هذه القيود، وقد استخدمت عدة جماعات تقنيات العزل القائم على تقارب لتنقية نوى التي وصفت مع حاتمة محددة في نوع خلية معينة. وقد تم مؤخرا تكييفها عزل نواة الموسومة في أنواع معينة الخلية (سليمة) طريقة تم تطويرها للاستخدام في نبات الأرابيدوبسيس thaliana 6، 7 لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 8. في هذا الأسلوب، وهو بروتين مغلف الاندماج النووي الذي هو الركيزة لفي الجسم الحي هو biotinylation coexpresااا مع كولاي البيوتين يغاز البيرة في أنواع معينة من الخلايا. نوى المسمى البيوتين يمكن تنقيته في وقت لاحق من السكان مختلطة باستخدام القائمة على streptavidin تقارب العزلة. باستخدام هذا النهج، وصفت بنجاح نوى ومعزولة عن الأديم المتوسط من أجنة ذبابة الفاكهة التي أعرب عن البروتين المغلف الانصهار النووي في ظل رقابة من الأديم المتوسط محسن محددة 8. إنشاء الكتاب أيضا البروتينات المغلف النووية الانصهار التي يمكن التعبير عنها في أي نوع من الخلايا تحت سيطرة تسلسل GAL4 التنظيمية، UAS 9. هذا النهج قادر على عزل مجموعات فرعية من النوى بسرعة وصفت من السكان مختلطة، ولكن يتطلب ثلاثة بنيات منفصلة المعدلة وراثيا، وبالتالي قد تكون غير مناسبة لتطبيقات خاصة الوراثية. في الآونة الأخيرة، وقد وصفت هذا النهج الذي تم الموسومة SUN (S AD1 و C-84 للامم المتحدة) والبروتينات التي تحتوي على المجال الذي توطين إلى الغشاء الداخلي من المغلف النووية معوأعرب عن البروتينات الفلورية تحت سيطرة النظام GAL4/UAS 10. تم عزل نواة في وجود المنظفات غير أيوني لإزالة الغشاء الخارجي المغلف النووية، وتنقية تقارب باستخدام الخرز المغناطيسي لجانب الأجسام المضادة للGFP. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لعزل المجموعات الصغيرة من النوى وصفت من أنواع فرعية محددة الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة 10.
هنا، يوصف بروتوكول لعزل نواة صفت من السكان خليط من الخلايا من الأنسجة ذبابة الفاكهة اليرقات. وقد تم تطوير هذه الطريقة بشكل مستقل، ولكن هو مماثل لنهج وصفها هنري وآخرون 10 الأولى، وصفت نوى مع علامة الفلورسنت التي يتم التعبير فقط في أنواع معينة من الخلايا في ذبابة الفاكهة السوداء البطن لتسهيل العزلة لاحقة من نوى الموسومة من السكان مختلطة استخدام النهج القائم على النسب. لتسمية نوى،وقد استخدمت KASH (K larsicht / A-NC 1 / S yne ح omology) المجال. المجال هو مجال KASH عبر الغشاء الذي يموضع إلى الغشاء الخارجي المغلف النووية، في جزء منه من خلال التفاعل مع SUN البروتينات التي تحتوي على النطاق داخل الفضاء محيط بالنواة 11. المجال KASH C-محطة من البروتينات مثل ذبابة الفاكهة MSP-300 وKlarsicht المراسي هذه البروتينات إلى الغشاء النووي الخارجي، في حين أن التفاعل المجالات-N محطة مع بروتينات الهيكل الخلوي الأكتين مثل الأنابيب الدقيقة أو في السيتوبلازم 12-14. تم إنشاؤها في بنيات الذي تنصهر المجال KASH من ذبابة الفاكهة MSP-300 إلى C-محطة من EGFP، تحت سيطرة تسلسل تنظيمي GAL4، UAS في pUAST-attB ناقلات 15 و 16. باستخدام التكامل في مواقع محددة phiC31، تم إنشاؤها الذباب المعدل وراثيا الذي UAS-EGFP :: تم إدراج MSP-300 KASH التحوير في مواضع attP2 على الصبغي3L 17. وUAS-EGFP :: MSP-300 KASH الذباب يمكن تجاوزه مع الذباب التي تعبر عن السائق GAL4 في نوع خلية معينة، مما أدى إلى التعبير المستهدفة من EGFP على الغشاء النووي الخارجي في نوع من الخلايا في المصالح. ويمكن بعد ذلك أن وصفت نوى تنقيته من السكان الخلية المختلطة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP جانب لحبات المغناطيسي. في هذا النهج، لا يلزم استخدام المنظفات غير أيوني لأن يتم ترجمة العلامة EGFP إلى الجانب حشوية من الغشاء النووي الخارجي، ويمكن الوصول إلى الأجسام المضادة وبالتالي.
البروتوكول هو موضح أدناه يمكن استخدامها لعزل / إثراء نوى المسمى EGFP من أنواع معينة من الخلايا في أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، لقياس العائد من النقاء والنوى معزولة، واستخراج الحمض النووي الريبي النووي مناسبة لكمية العكسية النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QRT -PCR) تحليل التعبير الجيني. عزل وتنقية تقارب من نوى (باستثناء TISSUه تشريح) لا يمكن أن يؤديها في أقل من ساعة واحدة. يتم عرض النتائج تبين أن نوى الدبقية يمكن أن تكون معزولة بنجاح من الفص البصري اليرقات والعين القرص تخيلي، وتستخدم لاحقة تحليل التعبير الجيني. ومن المتوقع أن هذا النهج سوف يكون من المفيد لعزل / إثراء نوى صفت من الأنسجة الجنينية واليرقات في الخلايا المستهدفة التي تشكل أقل من 5٪ من إجمالي عدد السكان. تتوفر جميع الأسهم ذبابة الفاكهة والبلازميدات ولدت في هذه الدراسة من الكتاب عند الطلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل أو إثراء للغاية على وجه التحديد نوى الموسومة من السكان الخلية المختلطة في ذبابة الفاكهة أو الأنسجة الجنينية اليرقات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن عزل نواة من أنسجة تشريح في حوالي 1 ساعة. يجب تحديد نقاء والعائد من النوى معزولة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جانيس فيشر لتوفير البلازميد UAS-EGFP :: MSP-300 KASH. تم الحصول على الضد mAB24B10 من دراسات البنك التنموي ورم هجين وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء. تم الحصول على الأوراق المالية الريبو-GAL4 (BL7415) من مركز بلومينغتون الأسهم في جامعة إنديانا. بدعم من جمعية السرطان الأمريكية المؤسسية بحوث غرانت (IRG # 58-006-53) لمركز جامعة بوردو لأبحاث السرطان هو اعترف بامتنان. ويدعم Jingqun ما قبل البحوث الزراعية في جامعة بوردو في مساعدة مالية للأغذية والزراعة من جامعة بوردو.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. 유전학. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
